王镜岩-生物化学-第35章DNA的重组

1、一、同源重组一、同源重组(homologous recombination) 发生在同源序列之间、发生在同源序列之间、非特异性重组非特异性重组 交换区交换区具有相同或相似的序列具有相同或相似的序列 两个DNA分子 重组酶重组酶涉及到双螺旋的断裂、修复、涉及到双螺旋的断裂、修复、 连接和重组体的释放连接和重组体的释放 相同的部位不同部位（异位重组）中心环节（一）同源重组的分子模型（一）同源重组的分子模型 Holliday模型模型片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体产生产生33单链末端单链末端DNA修复修复（二）细菌的基因转移与重组（二）细菌的基因转移与重组1、细菌的细菌的接合作用接合作用（c

2、onjugation）遗传物质从供体遗传物质从供体(donor)(donor)转移到转移到 受体受体(receptor)(receptor)的重组过程。的重组过程。供体细胞：雄性供体细胞：雄性受体细胞：雌性受体细胞：雌性接合质粒接合质粒：编码接合相关蛋白（如性菌毛）：编码接合相关蛋白（如性菌毛）致育因子（fertility factor）、F因子、性因子F因子因子 化学本质是化学本质是DNADNA 以以自主自主状态存在状态存在 或或整合整合到细菌的染色体上到细菌的染色体上 可在细菌细胞间可在细菌细胞间转移并传递转移并传递遗传物质遗传物质5性导性导(sexduction)与与F因子因子2、细菌的

3、细菌的遗传转化遗传转化（ transformation）细菌吸收外源细菌吸收外源DNADNA而发生遗传性状的改变而发生遗传性状的改变特点：特点：（1）感受态感受态与感受态因子与感受态因子 细菌能从环境吸收细菌能从环境吸收DNADNA的生理状态的生理状态 主要受感受态因子主要受感受态因子( (蛋白蛋白) )影响影响 感受态一般出现在细菌对数生长后期，可以诱导或加强感感受态一般出现在细菌对数生长后期，可以诱导或加强感受态受态（2）供体供体DNADNA与受体细胞结合与受体细胞结合结合发生在受体细胞特定部位结合发生在受体细胞特定部位对供体对供体DNADNA片段有一定要求片段有一定要求结合过程是一个可逆

4、过程结合过程是一个可逆过程（3）DNADNA摄取及整合摄取及整合结合点饱和后，细菌开始摄取外源结合点饱和后，细菌开始摄取外源DNADNA多为单链摄入，另一条链在膜上降解多为单链摄入，另一条链在膜上降解3、细菌的细菌的转导转导（ transduction）细菌基因通过噬菌体而转移细菌基因通过噬菌体而转移4、细菌的细菌的细胞融合细胞融合细胞质膜融合发生的基因转移与重组细胞质膜融合发生的基因转移与重组烈性噬菌体烈性噬菌体温和噬菌体温和噬菌体普遍性转导普遍性转导（generalized transduction） 完全转导 流产转导未整合整合局限性转导局限性转导（restricted transduc

5、tion） 特异性特异性转导转导 溶原期溶原期时噬菌体时噬菌体DNADNA整合在细菌染色体特定部位，整合在细菌染色体特定部位，噬菌体噬菌体DNADNA发生发生偏差分离偏差分离，将自身一段，将自身一段DNADNA留在细留在细菌染色体上，而带走了细菌菌染色体上，而带走了细菌DNADNA上的基因。上的基因。 当其转导并当其转导并整合到受体菌整合到受体菌中，使受体菌获得供体中，使受体菌获得供体菌的某些遗传性状。菌的某些遗传性状。所转导的只限于供体菌上个别的基因所转导的只限于供体菌上个别的基因普遍性转导与局限性转导的区别普遍性转导与局限性转导的区别区别要点区别要点普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导

6、转导发生的时期转导发生的时期裂解期裂解期溶原期溶原期转导的遗传物质转导的遗传物质供体菌供体菌DNADNA任何任何部位或质粒部位或质粒噬菌体及供体噬菌体及供体菌特定部位菌特定部位DNADNA转导的后果转导的后果完全转导或完全转导或流产转导流产转导受体菌获得供受体菌获得供体菌体菌DNADNA特定部特定部位的遗传特性位的遗传特性转导频率转导频率较低较低增加增加10001000倍倍（三）重组有关的酶（三）重组有关的酶 保守的保守的8 8碱基非对称序列碱基非对称序列 大肠杆菌大肠杆菌DNA每每5-10Kb自然发生一次自然发生一次 被被recBCD酶酶所识别所识别 刺激重组刺激重组重组热点重组热点1、ch

7、i 位点位点2、recBCD酶酶 解旋酶解旋酶活性：在活性：在SSB存在时解开双螺旋存在时解开双螺旋 ATP酶活性酶活性 核酸核酸外切酶外切酶活性活性 核酸核酸内切酶内切酶活性活性产生产生DNA单链单链RecBCD从一端从一端靠近靠近ChiChi位点位点在移动中降解在移动中降解DNA在在Chi位点位点3 4-6bp行使内切酶活性行使内切酶活性丢掉丢掉RecD只保留解旋酶活性只保留解旋酶活性3、RecA(chi)sequence具有物种，基因和具有物种，基因和genome seq.的特异性的特异性in E.coli genome 1000 chi-seq.chiRecBCD4-6bpOHRecA

8、-pDNA解旋解旋 再螺旋再螺旋 只要在入侵单链和双链之间有自由的末端只要在入侵单链和双链之间有自由的末端 RecA即可促进单链的同化即可促进单链的同化分支迁移分支迁移4、RuvAB复合物复合物置换置换RecA RuvA（四聚体）（四聚体） 识别识别Holliday连接体的结构连接体的结构 在交换点处与在交换点处与DNA四条链结合四条链结合 RuvB（六聚体）（六聚体） ATP酶，有解旋酶活性酶，有解旋酶活性 为分支迁移提供动力为分支迁移提供动力 核酸内切酶核酸内切酶 切开切开Holliday连接体连接体 识别不对称位点识别不对称位点ATTG5、RuvC二、特异位点重组二、特异位点重组（一）（

9、一）噬菌体噬菌体DNA的整合与切除的整合与切除1 1、 噬菌体噬菌体DNA的物理状态的物理状态裂解裂解phage： 为独立分子形式为独立分子形式 在受侵染细菌中为环状在受侵染细菌中为环状溶原状态：溶原状态： 是细菌染色体的整合部分是细菌染色体的整合部分（原噬菌体）（原噬菌体）整合整合切除切除整合在附着位点（整合在附着位点（attachment sites）上发生）上发生特异位点重组的结果特异位点重组的结果倒位倒位切除切除 特异的重组位点特异的重组位点附着位点附着位点 细细 菌菌attB，由由BOB组成组成 噬菌体噬菌体 attP，由由POP组成组成 O称为核心序列、称为核心序列、B、P称为臂称

10、为臂 重组酶重组酶整合酶（整合酶（integrase，Int） 非细菌重组所必需非细菌重组所必需 整合宿主因子整合宿主因子（integration host factor，IHF） Xis蛋白蛋白：改变：改变DNA结构，使其对整合呈惰性结构，使其对整合呈惰性 参与切除反应参与切除反应 噬菌体编码噬菌体编码宿主编码宿主编码整合反应整合反应交错交错7bp切开切开DNA（二二）鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛相变鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛相变（三三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白基因的重排三、转座重组三、转座重组转座子转座子（transposon）可以发生转座的可以发生转座的DNA转座元件本身转座元件本身可导致：可导

11、致：序列的缺失、插入以及将宿主序列转到新位点序列的缺失、插入以及将宿主序列转到新位点同源便携区同源便携区（portable region of homology）为重组提供底物位点为重组提供底物位点对表型有积极对表型有积极/消极的作用消极的作用（Selfish DNA）（一）细菌的转座因子（一）细菌的转座因子1、插入序列插入序列（Insertion Sequence，IS） 是简单转座模序是简单转座模序 只编码起始自己转座的蛋白只编码起始自己转座的蛋白 转座频率各异转座频率各异结构特点：结构特点：两侧末端为两侧末端为倒转重复倒转重复序列（序列（inverted repeats）旁侧为宿主旁侧为宿主DNA短短正向重复正向重复序列序列2、转座子转座子 带有带有编码转座功能酶编码转座功能酶的基因的基因 及及抗性抗性（或其他标记）基因（或其他标记）基因 组合因子：组合因子：插入序列插入序列标记基因标记基因插入序列插入序列两类结构两类结构 复合因子：复合因子： 转座酶基因转座酶基因 反向重复反向重复解离酶基因解离酶基因 反向重反向重复复 标记基因标记基因组合转座子结构组合转座子结构3 3、转座过程、转座过程转座酶识别转座酶识别形成中间体形成中间体 复制型转座复制型转座（replicative transponsition） 非复制型转座非复制型转