生物分离工程 电泳和电色谱技术

1、生物分离工程生物分离工程电泳和电色谱技术电泳和电色谱技术学习总体要求学习总体要求 掌握电泳概念，电泳速度及凝胶电泳，了解掌握电泳概念，电泳速度及凝胶电泳，了解其他几种常见电泳原理及特点，操作及应用。其他几种常见电泳原理及特点，操作及应用。 电泳及电泳分离电泳及电泳分离n电泳电泳 电泳是荷电溶质（电解质）在电场作用下发电泳是荷电溶质（电解质）在电场作用下发生定向泳动的现象。生定向泳动的现象。n电泳分离电泳分离 利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法，称为电泳分离。分离的方法，称为电泳分离。电泳分类电泳分类n根据电泳原理分类根据电泳原理分类 区带电泳

2、；区带电泳； 等电点电泳（等电聚焦）；等电点电泳（等电聚焦）； 等速电泳；等速电泳；n根据电泳载体分类根据电泳载体分类 凝胶电泳；凝胶电泳； 自由流电泳；自由流电泳； 电色谱电色谱 电泳与色谱原理相结合可以派生多种复合分电泳与色谱原理相结合可以派生多种复合分离方法离方法n电泳色谱电泳色谱(electrophoretic chromatography) 将溶质的电泳迁移与色谱分离相结合将溶质的电泳迁移与色谱分离相结合n电色谱电色谱(electrochromatography) 利用电渗作为驱动流动相流动，分离作用源于溶质利用电渗作为驱动流动相流动，分离作用源于溶质在固定相和流动相间的分配平衡特性

3、在固定相和流动相间的分配平衡特性基础理论基础理论 n识记识记：电泳、迁移率、电渗流概念：电泳、迁移率、电渗流概念n理解理解：了解自由溶液中的电泳速度和凝胶中的：了解自由溶液中的电泳速度和凝胶中的电泳速度电泳速度电解质在电场中运动电解质在电场中运动阴离子阳离子自由溶液中电泳速度自由溶液中电泳速度 n荷电溶质在电场中所受的静电引力荷电溶质在电场中所受的静电引力f与溶质的与溶质的荷电荷数荷电荷数z及电场强度及电场强度E成正比，其表示为成正比，其表示为n荷电溶质在自由溶液中受到的阻力荷电溶质在自由溶液中受到的阻力f为为 n当两者之间达到平衡后，当两者之间达到平衡后， fE Ze6efr v ff06e

4、eZEvu Er 电解质溶质迁移率电解质溶质迁移率真实电泳速度真实电泳速度 在实际过程中，根据双电层理论，荷电溶质的在实际过程中，根据双电层理论，荷电溶质的表面附近存在距表面由高到低的反离子分布。表面附近存在距表面由高到低的反离子分布。当荷电溶质的表面电位（当荷电溶质的表面电位（0）很小时，电位）很小时，电位沿表面附近半径方向的变化可用如下的指数函沿表面附近半径方向的变化可用如下的指数函数表示，数表示， 0 xe121322 10Bk Te NI真实电泳速度真实电泳速度n考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的迁移率变为迁移率变为 1r061eZfrurr

5、1r1.5fr1fr204 reZu 06eZur 凝胶浓度的表示法凝胶浓度的表示法n电泳分离中常用的聚丙烯酰胺凝胶是由丙稀酰胺单体和交联剂N, N-甲叉双丙稀酰胺在催化剂和引发剂的作用下共聚调制，凝胶浓度可用如下公式表示 %100mbaTg100%gbcab凝胶浓度：交联浓度：丙烯酰胺单体质量；交联剂单体质量；缓冲液质量；abm凝胶中的电泳速度凝胶中的电泳速度 n当一定交联浓度时，聚丙稀酰胺凝胶中电泳迁移速率和凝胶浓度之间有如下关系 grTKuu0loglog为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数；为外插到Tg0时的迁移率；rK0u电渗流速度电渗流速度n电渗流是荷电固体表面诱导的双电层中反离电渗流

6、是荷电固体表面诱导的双电层中反离子在电场作用下发生定向迁移引起的。子在电场作用下发生定向迁移引起的。n电渗流可用下式表示：电渗流可用下式表示：0wLEv+-凝胶电泳学习要点凝胶电泳学习要点n理解理解：凝胶电泳原理，等速电泳的原理特点，：凝胶电泳原理，等速电泳的原理特点，以及分离操作和分离特性以及分离操作和分离特性凝胶电泳定义凝胶电泳定义n凝胶电泳是利用凝胶分子筛作用使分子大小凝胶电泳是利用凝胶分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离的电泳分离方法。不同的电解质得到分离的电泳分离方法。凝胶电泳原理n原理原理 在凝胶电泳过程中，不同分子量的荷电溶质在迁移过程中在凝胶电泳过程中，不同分子量的荷电溶质

7、在迁移过程中的的泳动速度泳动速度是不同的。是不同的。相对分子量较大相对分子量较大的溶质受凝胶阻滞作的溶质受凝胶阻滞作用较大，泳动速度慢；相反，用较大，泳动速度慢；相反，分子量小分子量小的溶质泳动速度较快。的溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含不同溶质的区带，实现溶质间的分离。胶中形成数条含不同溶质的区带，实现溶质间的分离。n凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液中溶质的相对分子量而异。中溶质的相对分子量而异。n凝胶电泳的特点是凝胶柱中凝胶浓度和凝

8、胶电泳的特点是凝胶柱中凝胶浓度和pHpH值均一。值均一。不连续凝胶电泳形式不连续凝胶电泳形式 n不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成。成。n上层凝胶浓度在上层凝胶浓度在2-3% Tg，其凝胶孔径很大，凝胶，其凝胶孔径很大，凝胶对溶质的泳动基本上无阻滞作用，表现为对溶质的泳动基本上无阻滞作用，表现为等速泳动等速泳动，溶质在此层得到浓缩；溶质在此层得到浓缩；n下层凝胶浓度在下层凝胶浓度在5-25% Tg ，凝胶具有一定的孔径，凝胶具有一定的孔径，各组分根据荷电量和迁移率的差别得到分离。因此，各组分根据荷电量和迁移率的差别得到分离。因此，上层称为

9、浓缩层或浓缩胶；下层称为分离层或分离上层称为浓缩层或浓缩胶；下层称为分离层或分离胶。胶。 等速电泳的原理等速电泳的原理 n在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离子（一般为强电解质离子，子（一般为强电解质离子，Cl-）；迁移率最小的阴）；迁移率最小的阴离子为末尾离子（一般为甘氨酸）；离子为末尾离子（一般为甘氨酸）；n电泳开始前，将含有目标蛋白质的料液加入到前导电泳开始前，将含有目标蛋白质的料液加入到前导离子和末尾离子之间；料液区的离子和末尾离子之间；料液区的pH值高于前导离子值高于前导离子区的区的pH值；值；n在前导离子区，前导离子的浓度与反离子

10、的浓度一在前导离子区，前导离子的浓度与反离子的浓度一定时，由于定时，由于pH值不变，其泳动速度为一定值；值不变，其泳动速度为一定值；n末尾离子根据其处位置的末尾离子根据其处位置的pH值所产生的解离度和离值所产生的解离度和离子迁移率将向阳极（带负电荷）或阴极（带正电荷）子迁移率将向阳极（带负电荷）或阴极（带正电荷）移动；移动；等速电泳的原理等速电泳的原理(续续)n料液中移动速度最快的组分料液中移动速度最快的组分A（pH高）首先进入前高）首先进入前导离子区，但由于前导离子区导离子区，但由于前导离子区pH值较低，溶质的解值较低，溶质的解离度减小（所带负电荷变少，离度减小（所带负电荷变少，pH降低），

11、泳动速度降低），泳动速度减慢。因此，其被排挤出前导离子区，从而在前导减慢。因此，其被排挤出前导离子区，从而在前导离子区和混合料液区交界处组分浓度增加；离子区和混合料液区交界处组分浓度增加；n同时，为了与反离子保持电中性，该处溶液同时，为了与反离子保持电中性，该处溶液pH值降值降低；低；n在此降低的在此降低的pH值下，其它组分不能与组分值下，其它组分不能与组分A以相同以相同的速度泳动而拖后；的速度泳动而拖后；n随着时间的推移，所有的溶质都开始形成独自的区随着时间的推移，所有的溶质都开始形成独自的区带，显示与该区带内的弱酸离子和反离子浓度相应带，显示与该区带内的弱酸离子和反离子浓度相应的的pH值。

12、值。等速电泳的特点等速电泳的特点n各个组分间形成相互连接的独自区带，显示各个组分间形成相互连接的独自区带，显示各自与对离子相应的各自与对离子相应的pH值；值；n提高前导离子的浓度可以使溶质得到浓缩；提高前导离子的浓度可以使溶质得到浓缩；n采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作间隔物，可使目标蛋白与其它蛋白质前后作间隔物，可使目标蛋白与其它蛋白质完全分离；质完全分离；不连续凝胶的分离操作不连续凝胶的分离操作 不连续凝胶层的上部和下部分别使用不连续凝胶层的上部和下部分别使用pH值不同值不同的缓冲液，其中上部缓冲液根据待分离蛋白质等电点的缓冲液，其中上部

13、缓冲液根据待分离蛋白质等电点选定。选定。n上层浓缩层采用上层浓缩层采用pH 6.8的缓冲液，下层分离层采用的缓冲液，下层分离层采用pH 8.3的缓冲液；的缓冲液；n上层中，料液中蛋白质夹在前导离子和末尾离子之间上层中，料液中蛋白质夹在前导离子和末尾离子之间在浓缩层内等速泳动，达到等速电泳状态后进入下层在浓缩层内等速泳动，达到等速电泳状态后进入下层分离凝胶；分离凝胶；n下层中蛋白质受到高浓度凝胶的分子筛作用，末尾离下层中蛋白质受到高浓度凝胶的分子筛作用，末尾离子会超过蛋白质，蛋白质依据荷电量和分子大小分离；子会超过蛋白质，蛋白质依据荷电量和分子大小分离； 影响不连续凝胶分离的因素影响不连续凝胶分

14、离的因素n缓冲液的缓冲液的pH值、组成值、组成 调节调节pH值可以改变荷电量值可以改变荷电量Z；n分离胶的浓度或交联度分离胶的浓度或交联度 调节凝胶浓度可改变迁移率；调节凝胶浓度可改变迁移率；n外加电压外加电压等电点聚焦学习要点等电点聚焦学习要点n理解理解：等电点聚焦的原理及特点：等电点聚焦的原理及特点 等电点聚焦定义等电点聚焦定义 等电聚焦是利用蛋白质和氨基酸等两性电等电聚焦是利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的解质具有等电点，在等电点的pH值下蛋白质值下蛋白质呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离的呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离的方法。方法。 形成连续梯度的化合物形

15、成连续梯度的化合物 IEF的关键是调配稳定的连续的关键是调配稳定的连续pH值梯度，一般采值梯度，一般采用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸，其带有许多正负电用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸，其带有许多正负电荷，这类物质具有与蛋白质相近似的等电点范围，缓荷，这类物质具有与蛋白质相近似的等电点范围，缓冲能力强，冲能力强，pH值梯度稳定。其结构如下值梯度稳定。其结构如下 在无外加电场作用时，作为载体的两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH值范围的平均值。 稳定稳定pH梯度的形成梯度的形成 在电场作用下，组成溶液的在电场作用下，组成溶液的无机盐电解质无机盐电解质（如硫酸钠等）（如硫酸钠等）在阳极聚焦在阳极聚焦硫酸

16、硫酸而在阴极聚焦而在阴极聚焦氢氧化钠氢氧化钠。如果此时有载体存。如果此时有载体存在于溶液中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带在于溶液中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电。这样载体正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电。这样载体就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设其中有一就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设其中有一个酸性最强的两性电解质个酸性最强的两性电解质A（pI值最小），当它由阴极逐渐接值最小），当它由阴极逐渐接近阳极的硫酸时，就会失去电荷而停止运动。由于它有高的近阳极的硫酸时，就会失去电荷而停止运动。由于它有高的

17、缓冲能力，使环境溶液的缓冲能力，使环境溶液的pH值等于值等于A的等电点，的等电点，A所在的位所在的位置就是它的等电点，另有一个等电点稍高于两性电解质置就是它的等电点，另有一个等电点稍高于两性电解质A的物的物质质B，当向阳极运动靠近，当向阳极运动靠近A时，它不能超过时，它不能超过A，因为那里低于，因为那里低于它的等电点。于是它的等电点。于是B将带正电荷而向阴极移动，它只能排在将带正电荷而向阴极移动，它只能排在A的阴极侧。的阴极侧。IEF原理原理 蛋白质在电场作用下泳动到等于各自等蛋白质在电场作用下泳动到等于各自等电点的电点的pH值区域形成具有不同等电点的蛋白值区域形成具有不同等电点的蛋白质区带；

18、质区带； IEF特点特点n受溶质扩散影响小，受溶质扩散影响小，IEF可消除分子扩散引可消除分子扩散引起的分离度下降。起的分离度下降。n两性电解质的加入对产品产生两性电解质的加入对产品产生污染污染；npH梯度梯度稳定性稳定性不高；不高；n操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象；操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象；二维电泳学习要点二维电泳学习要点n理解理解：上述电泳原理和特点：上述电泳原理和特点n应用应用：了解上述电泳技术的适用范围：了解上述电泳技术的适用范围二维电泳定义二维电泳定义 二维电泳是同时利用分子的大小和等电点这二维电泳是同时利用分子的大小和等电点这两种特性的差别进行蛋白质等生物大分子的两种特性

19、的差别进行蛋白质等生物大分子的电泳分离方法。电泳分离方法。二维电泳原理二维电泳原理 在凝胶电泳槽的在凝胶电泳槽的y方向上具有浓度分布，而在方向上具有浓度分布，而在x方向上首先调配方向上首先调配pH值梯度，使溶质分子以等电点值梯度，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其等电点处。然后将适当聚焦的形式泳动到其等电点处。然后将适当pH值值的缓冲液渗透到凝胶中，在的缓冲液渗透到凝胶中，在y方向上加电场使溶质方向上加电场使溶质再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及分再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及分子量的影响，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，相子量的影响，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，相互之间

20、得到进一步分离。互之间得到进一步分离。二维电泳凝胶电泳等电点聚焦二维电泳特点二维电泳特点n分离度高，可分离等电点相差分离度高，可分离等电点相差0.01个个pH值的值的蛋白质；蛋白质；n处理量小，适用于分离微量的高纯度目标产处理量小，适用于分离微量的高纯度目标产物，用于科学研究；物，用于科学研究； 逆向作用层析电泳学习要点逆向作用层析电泳学习要点n理解理解：逆向作用层析电泳原理和特点：逆向作用层析电泳原理和特点n应用应用：了解逆向作用层析电泳技术的适用范围：了解逆向作用层析电泳技术的适用范围逆向作用层析电泳原理逆向作用层析电泳原理 逆向作用层析电泳是利用填充两层具有不同排逆向作用层析电泳是利用填充两层具有不同