第六章 植物原生质体融合技术-黄秀梅

1、第六章第六章 植物原生质体融合技术植物原生质体融合技术Plant Protoplast Fusion What 基本原理基本原理 Why 技术应用技术应用 How 技术方法技术方法微微 丝丝叶绿体叶绿体线粒体线粒体质质 膜膜液液 泡泡细胞核细胞核内质网内质网微微 管管细胞壁细胞壁高尔基体高尔基体细胞壁由三种主要成分构成细胞壁由三种主要成分构成纤维素纤维素25-50%、半纤维素半纤维素53%和果胶和果胶5% What 基本原理基本原理 去除植物细胞壁以获得大量的原生质体去除植物细胞壁以获得大量的原生质体 诱导原生质体融合形成杂种细胞诱导原生质体融合形成杂种细胞 筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化

2、筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化 从细胞团，愈伤组织到最后成株从细胞团，愈伤组织到最后成株植物原生质体融合基本过程植物原生质体融合基本过程 Why 技术应用技术应用植物原生质体融合的意义：克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件 How 植物原生质体融合技术方法植物原生质体融合技术方法 植物原生质体的制备植物原生质体的制备 植物原生质体的培养植物原生质体的培养 植物原生质体的融合植物原生质体的融合1、原生质体的概念及培养的意义、原生质体的概念及培养的意义2、原生质体材料来源、原生质体材料来源3、原生质体的分离、原生质体的分离4、原生质体的纯化、原生质体

3、的纯化 概念：概念： 除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体 植物叶片植物叶片取材容易取材容易比较容易用酶解法分离比较容易用酶解法分离 植物根尖组织植物根尖组织可由各种植物的种子萌发后可由各种植物的种子萌发后取得取得 植物花粉植物花粉产生单倍体原生质体产生单倍体原生质体 愈伤组织、悬浮培养的细胞愈伤组织、悬浮培养的细胞细胞壁容易解离细胞壁容易解离与分离试剂相与分离试剂相同同与分离试剂相同与分离试剂相同FDA法的原理法的原理vFDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出自由出入细胞膜入细胞膜。v在在活活细胞中，细胞中，FDA被酯酶被酯酶裂解裂解，释放出有，释放

4、出有极性的荧极性的荧光素光素。v荧光素荧光素不能自由穿越不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。质膜，在活细胞中积累。v荧光素在荧光素在死细胞中不能积累死细胞中不能积累。v在在UV照射下照射下，活细胞中的荧光素发出，活细胞中的荧光素发出绿色荧光绿色荧光。FDA荧光素荧光素活细胞活细胞死细胞死细胞请思考请思考活细胞活细胞死细胞死细胞FDA先用丙酮配成先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为的母液，终浓度为0.01%原生质体分离纯化流程图原生质体分离纯化流程图 浅层液体培养法：浅层液体培养法：在培养皿或三角瓶中注入34ml原生质体培养液，然后将纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养 固体培养法固体培

5、养法 原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培养基中 此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形成的全过程进行定点观察 双层培养法双层培养法在固体培养基上，加入适宜原生质体胞壁再生和细胞分裂的液体培养基细胞壁再生：细胞壁再生： 体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。细胞分裂形成细胞团：细胞分裂形成细胞团： 一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。器官形成植株再生：器官形成植株再生： 从愈伤组织诱导发生 胚状体发育原生质体的活力原生质体的活力 影响因素：制备原生质体的方

6、法，渗透压稳定剂种类、浓度，质膜稳定剂种类、浓度，温度和保温时间原生质体密度原生质体密度 起始密度一般为104-105 个/mL细胞壁再生速度细胞壁再生速度 植物种类和取材的生理状态；培养细胞所处的时期；酶解时所用质膜稳定剂种类原生质体培养的营养和环境原生质体培养的营养和环境 培养基 原生质体培养的环境：光照、温度、湿度 细胞融合细胞融合(cell fusion)(cell fusion)概念：概念： 又称细胞杂交(cell hybridizaion)：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 细胞融合的意义：细胞融合的意义： 克服种、属以上植物有性杂交不亲和性

7、障碍 为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件植物原生质体融合基本过程植物原生质体融合基本过程 盐类融合法 高Ca2+和高pH值融合 聚乙二醇（PEG）融合法 PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 电融合法A. 盐类融合法盐类融合法 盐类融合剂种类盐类融合剂种类硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 盐类融合的优缺点盐类融合的优缺点优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合B. 高高Ca2+和高和高pH值融合值融合 Ca

8、2+浓度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5具体做法具体做法( (以烟草为例以烟草为例) ) 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合; 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37下保温0.5h; 用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； 两种原生质体的融合率达到10%。C. 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）融合法）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间 融合机制融合机制：

9、可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着结合 用相对分子质量为1540的PEG处理40-50 min；再用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核体D. PEG与高与高Ca2+和高和高pH值结合融合法值结合融合法 先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥） 然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG；（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合） 再用培养液洗去高Ca2+和高pH值PEG诱导原生质体融合过程诱导原生质体融合过程E. 电融合法电融合法 原理：原理： 改变原生质体质膜表

10、面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 优点：优点： 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。电融合基本过程1. 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中2. 微电极型：用5-12微安的脉冲电流间断刺激1-5毫秒，原生质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最

11、后形成融合体,整个过程约10-30分3. 平行多电极融合装置法：经过1兆赫如150V/cm交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流电脉冲(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体细胞电融合过程细胞电融合过程原生质体的融合过程包括原生质体的融合过程包括3 3个主要阶段个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；两个或多个原生质体的质膜彼此靠近；2)2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。融合完成，形成球形的异核体或

12、同核体。 PEGPEG诱导法：诱导法：PEG规格、纯度，作用时间 电诱导法：电诱导法：原生质体密度交流电压 交变电场的振幅频率交变电场的处理时间直流高频电压脉冲宽度脉冲次数 A、融合体的类型、融合体的类型B、杂种细胞选择的方法、杂种细胞选择的方法C、细胞杂种的鉴定、细胞杂种的鉴定A、融合体的类型、融合体的类型 自体融合：自体融合：发生在亲本原生质体自身 异体融合异体融合谐和的细胞杂种谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体部分谐和的细胞杂种部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少量染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株异胞质体细胞杂种异胞质体细胞杂

13、种：亲本的染色体全部被排斥，但胞质是双亲的嵌合细胞杂种嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物B、杂种细胞选择的方法、杂种细胞选择的方法 互补选择法互补选择法( (遗传或抗性遗传或抗性) )： 选择一个叶绿体缺失突变体，这一突变体在限定培养基上，能分裂、分化形成植株。具有正常叶绿素的植株，在上述限定培养基上，则不能分裂形成大细胞团（愈伤组织） 可见标记法：可见标记法： 凹穴培养皿分离法：根据融合后异核体和亲本原生质体的形态特征之区别 微吸管分离法：用一种向吸管根据可见标记吸取异核体，进行“看护培养

14、”，以获得杂种植物 生长特性选择法：生长特性选择法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 物理特性选择法：物理特性选择法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种。 其他方法：其他方法：如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）和和异硫氰酸罗丹明（异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出分别发出绿色绿色和和红色红色 荧光染料法荧光染料法两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。光染料进行染色。细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。细胞分类器辨

15、别和收集发两种荧光的异核体。但仪器价格昂贵，不常用。但仪器价格昂贵，不常用。C、细胞杂种的鉴定、细胞杂种的鉴定（1 1）杂种植物形态特征、特性鉴定）杂种植物形态特征、特性鉴定（2 2）杂种植物的核型分析）杂种植物的核型分析（3 3）同工酶分析）同工酶分析（4) 4) 分子标记鉴定：分子标记鉴定： RFLPRFLP鉴定、鉴定、RAPDRAPD 标标记鉴定记鉴定18条染色体条染色体36条染色体条染色体几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子 融合生物种类融合生物种类 细胞来源细胞来源 成功年代成功年代烟草两个种间 叶叶 1972甘蓝青菜 叶根 1972大豆马唐草 愈伤组织叶 1972矮牵牛龙面花 叶花瓣 1973 大麦花生 种子种子 1974大麦大豆 叶悬浮细胞 1974小麦矮牵牛 叶花瓣 1974玉米大豆 叶悬浮细胞 1974大豆野碗豆 悬浮细胞 悬浮细胞 1974大麦蚕豆 叶根 1975大豆草香木犀 悬浮细胞 叶 1976酵母菌鸡 原生质体血红细胞 1976大豆烟草 悬浮细胞 叶 197