上海交大第10章生化 (刘建华)

1、BiochemistrySixth EditionChapter 10:Regulatory StrategiesCopyright 2007 by W. H. Freeman and Company Berg Tymoczko Stryer如同机动车交通，用信号调节代谢途径流动效率更高。CTP是一个多步骤反应的最终产物。CTP抑制限速步骤催化酶（即天冬氨酸-氨基甲酰转移酶ATCase）活性能够控制这个代谢途径。酶活性的调节方式主要有五种。1. 变构控制。变构蛋白质含有调节位点和多个活性位点。信号小分子与调节位点结合,控制酶蛋白活性。变构蛋白有协同性：一个活性位点的活性影响其它活性位点。因此有

2、变构蛋白能够将信号分子或同一酶蛋白活性位点的信息传递给蛋白质，调节酶蛋白活性。2. 酶的多重形式。同功酶（isozyme，isoenzyme）是在不同位置或时间调节酶活性的另一种形式。同功酶是同一生物体内存在的催化同一反应的同源酶，它们之间在结构上稍有差异，但是催化反应的Km和Vmax，以及调节特性差异显著。通常同功酶随表达的时间、地点和发育状态而改变。3. 可逆共价修饰。有很多酶共价连接一个基团后催化活性显著改变，最常见的修饰基团是磷酸。ATP是磷酸供体，催化的酶是蛋白激酶。蛋白磷酸酯酶负责删除蛋白质的磷酸基团。4. 蛋白裂解活化。有些调节使酶蛋白活性能够来回变化，使之处于有活性和无活性两种

3、状态。还有一种调节方式是酶蛋白活性不可逆转地激活。只要水解少数几个肽键甚至一个肽键就能够酶激活的蛋白质称为酶原(zymogen, or proenzyme)。这种机制能够产生消化酶如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、和胃蛋白酶。血液凝固就是酶原激活的级联反应。特异抑制蛋白与分子靶标不可逆结合关闭凝血过程。5. 酶量控制。调节酶量也是调节酶活性的一种方法。通常在转录水平进行这种调节。在31章我们将介绍这种调节模式。图图10.1 ATCase酶促反应。酶促反应。ATCase催化嘧啶合成途经的限速反应，天冬氨酸与胺酰基磷酸的缩合生成N-氨甲酰天冬氨酸。天冬氨酸天冬氨酸- -氨基甲酰转移酶是一种变构氨基甲酰转移

4、酶是一种变构调节酶，受该途径终端产物抑制调节酶，受该途径终端产物抑制 图图10.2 CTP抑制抑制ATCase酶促反应。酶促反应。尽管CTP与反应物或产物没有结构类似性，但是CTP能够抑制ATCase活性。图图10.3 ATCase酶促反应动力学呈酶促反应动力学呈S曲线。曲线。天冬氨酸-氨基甲酰转移酶催化反应得产物形成速度对底物Asp浓度作图呈S型曲线，表明一个活性位点结合底物能够增加这个酶蛋白分子其它位点的活性。因此这个酶是正协同酶。ATCase含有独立的催含有独立的催化亚基和调节亚基。化亚基和调节亚基。图图10.4 半胱氨酸残基的修饰。半胱氨酸残基的修饰。对羟基汞苯甲酸与天冬氨酸-氨基甲酰

5、转移酶关键的半胱氨酸反应。图图10.5 超离心研究超离心研究ATCase酶。酶。天然ATCase （A）和经过p-羟基汞苯甲酸处理的ATCase的沉降速度显示酶蛋白可以分成催化亚基( c) 和调节亚基 ( r )。 较大的亚基称为催化亚基。这个亚基有催化活性，但是不受CTP调节，其催化动力学也不呈S曲线。较小的亚基能够结合CTP，但是没有催化活性，称为调节亚基。催化亚基有三条多肽链，称为c3 (每条多肽链有34 kD)。调节亚基有两条多肽链，称为r2 (每条多肽链有17 kD)。将催化亚基和调节亚基混合，两者能迅速结合成与天然ATCase一样的c6r6 （即两个催化亚基和三个调节亚基结合而成的

6、复合物）。 2 c3 + 3 r2 = c6r6重组酶的催化动力学性质和变构调节性质与天然酶完全相同。因此，ATCase有独立的调节亚基和催化亚基。天然酶分子中催化亚基与调节亚基之间相互作用产生了酶促特性和变构调节特性。 亚基之间究竟是什么作用能够解释ATCase的特性？大量的思路来自ATCase的三维结构测定。William Lipscomb实验室首先用x-晶体衍射测定ATCase结构。两个催化三体叠加在一起，三体之间用调解多肽链联系起来（图10.6）。催化亚基和调节亚基之间有大量接触：调节亚基（二聚体）的每条r链与催化三体的一条c链相互作用。一个Zn 2+与四个半胱氨酸残基结合稳定c链与r

7、链的一个结构域接触。汞化合物p-羟基汞苯甲酸与半胱氨酸结合力强，替代Zn 2+导致r-链结构域不稳定，结果催化亚基和调节亚基发生解离。图图10.6 ATCase结构。结构。（A）从顶部观察天冬氨酸-氨基甲酰转移酶的四级结构。中间图仅仅代表亚基之间的关系。只能看到一个催化三体（黄色）的c链，另一个催化亚基（三体）被遮住。一个r链经过Zn 2+离子与一个c链相互作用。（B）ATCase侧视图。 为了确定活性位点，在N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸（PALA）存在的情况下进行ATCase结晶。PALA是双底物类似物，类似于催化途径的中间物（图10.7）。双底物类似物ATCase-PALA复合物结构显示，

8、PALA结合于催化亚基三聚体两个相邻的c链之间。图图10.8 ATCase酶的活性位点。酶的活性位点。与PALA抑制剂结合的一些关键位点的残基特异标出。活性位点的氨基酸残基主要有一个c链提供，相邻c链也提供了一些重要侧链（用绿色方框标出）。PALA与ATCase结合导致酶四级结构变化显著。两个催化三聚体亚基之间疏远了12A，旋转了10o。相应地，调节亚基叶旋转了15o以适应之。因此PALA与ATCase结合导致美蛋白分子膨大。图图10.9 ATCase酶的酶的T态向态向R态转化。态转化。天冬氨酸-氨基甲酰转ATCase移酶有两种结构状态，即活性低的T态和活性高的R态。从T态转变成R态结构变化明

9、显。PALA结合能够稳定蛋白质的R态结构。图图10.10 S型曲线的基础。型曲线的基础。将变构酶想象成两种米氏酶的混合物，一种酶Km低（相当于R态结构），一种酶Km高（相当于T态结构）。随着底物浓度的增加，平衡从T向R移动，导致反应速度虽底物浓度增加急剧增高。 ATCase的S型曲线可以看作是两种米氏酶(一种是T态酶，另一种是R态酶)酶促反应的叠加。底物浓度的增加有助于酶促反应从T态曲线转化成R态曲线（图10.10）。注意这种S型动力学曲线有另一个结果，当底物浓度达到T向R转化时，增加底物浓度使酶促反应速度急剧上升。酶分子从活性低转变成活性高的底物浓度区间很窄。如果细微的浓度变化就需要应答的话

10、，这种酶促行为就非常有用。底物对变构酶的这种效应叫同质效同质效应应（homotropic effects）。图图10.12 R态与态与T态处于平衡状态。态处于平衡状态。即使没有底物，没有调节因子，天冬氨酸-氨基甲酰转移酶的结构处于R态和T态之间的平衡状态。此时，T态比R态多200倍。图图10.13 CTP对对ATCase的影响。的影响。CTP稳定T态结构，使ACTase更难与底物结合，更难转变成R态, 动力学曲线右移（红色）。ATP也是ATCase的别构效应剂。但是ATP能够增加特定底物浓度时ATCase酶促反应速率（图10.14）。ATP浓度愈高，S形曲线就越不明显。ATP与CTP竞争性结合

11、ATCase的调节位点。结果，ATP浓度高阻止CTP与ATCase结合。非底物分子对变构酶的影响称为异质效异质效应应（heterotropic effects）。 图图10.14 ATP对对ATCase动力学的影响。动力学的影响。ATP是ATCase的异质活化剂，因为它能够稳定蛋白质的R态结构，使蛋白质易于与底物结合。结果动力学曲线向左边移动（蓝色）。ATP浓度增加导致ATCase活性高有两个潜在的生理意义。ATP浓度高表示细胞内嘌呤的密度高，需要增加ATCase活性促成细胞内嘌呤和嘧啶的平衡。ATP的浓度高表明细胞内能量充足，能用来合成mRNA和复制DNA，也需要合成更多的嘧啶。 L = T

12、/R图图10.15 MWC模型的定量表述。模型的定量表述。活性位点比例Y对底物浓度（用a表示，a是底物浓度与R态酶-底物复合物解离常数的比值）作图。L是T态酶浓度与R态酶浓度之间的比值。与ATCase的结合，ATP和CTP能够改变L值，从而改变酶对底物浓度的应答。同功酶是进行组织特异性和时间特异性调节同功酶是进行组织特异性和时间特异性调节的一种方式的一种方式同功酶同功酶(isozyme，或，或isoenzyme)是同一生物体是同一生物体内，氨基酸序列不同，但催化同一化学反应内，氨基酸序列不同，但催化同一化学反应的酶。通常这些酶的动力学常数（如的酶。通常这些酶的动力学常数（如Km值）值），或者对

13、不同调节信号的应答能力不同。这，或者对不同调节信号的应答能力不同。这些酶的编码基因不同，通常是同一基因发生些酶的编码基因不同，通常是同一基因发生重复和差异化所致。通常利用生化性质例如重复和差异化所致。通常利用生化性质例如电泳迁移率差异区分同功酶。电泳迁移率差异区分同功酶。 大鼠发育过程中，心脏LDH表达谱的变化情况。H亚基用方块表示，M亚基用圆圈表示。负数表示出生前的天数，正数表示出生后的天数。 成年大鼠不同组织的成年大鼠不同组织的LDH同功酶同功酶 有些同功酶在血液中出现表示相应组织出现损伤，可以用作临床诊断指标。 血清中H4（相对于H3M）水平增加表示心肌破裂(Myocardial inf

14、raction)或心脏病，损伤心肌细胞导致胞内组分释放。 10.3 共价修饰时调节酶活性的一种方式共价修饰时调节酶活性的一种方式 与另一个分子共价连接能够调节酶促活性和蛋白质活性。在这方面，供体分子提供蛋白质共价连接的功能基团。大多数修饰是可逆的。最常见的共价修饰是磷酸化和去磷酸化磷酸化和去磷酸化。乙乙酰化和去乙酰化酰化和去乙酰化是另一种常见的蛋白共价修饰。将DNA包装压缩成染色体的蛋白质，即组蛋白，在或体内有深度的乙酰化和去乙酰化（31.3节）。活跃转录基因所结合的组蛋白，乙酰化程度更高。乙酰基转移酶和去乙酰酶自身的活性受磷酸化-去磷酸化调节。说明修饰酶的共价修饰可能调节蛋白质共价修饰。有些

15、情况下共价修饰不可逆。在信号传导过程中蛋白质不可逆地与脂质分子共价连接，变成面向细胞浆的固定于细胞质膜的蛋白质，如Ras（一种GTPase）和Src(一种蛋白酪氨酸激酶)。固定在这种地方，蛋白质更能够接受沿信号途径传递的信号，并将信号向下游传递（第14章）。有些癌症，其Ras和Src有变异。与小蛋白ubiquitin连接，是销毁该蛋白的信号，也是一种调节方式（第23章）。当细胞经过细胞周期进入细胞分裂后期(anaphase)之前，就得使蛋白质cyclin与ubiquitin连接并销毁之。乙酰化赖氨酸磷酸化是调节目标蛋白或性的有效方式磷酸化是调节目标蛋白或性的有效方式 真核细胞各种代谢途径的调节

16、方式几乎都用到磷酸化机制。实际上，细胞内有30%的蛋白质被磷酸化。催化磷酸化反应的酶叫蛋白激酶。这些酶构成了目前所知的最大的蛋白家族。酵母有100多种同源蛋白激酶，人类有500多种同源蛋白激酶。品种众多的蛋白激酶使之能够精细调节各种活性以满足特定组织、特定时间、和特定底物的需求。 ATP是最常用的磷酸供体分子。ATP的g-磷酸能够转移给蛋白质特定的氨基酸。在真核生物，磷酸受体是三个侧链带有羟基的氨基酸。一类蛋白激酶能够将磷酸转移给丝氨酸或苏氨酸，另一类蛋白激酶能够将磷酸转移给酪氨酸。多细胞生物独有的酪氨酸蛋白激酶在生物生长控制方面起非常重要的作用。通常癌细胞含有这些蛋白激酶的变异。磷酸基团的受

17、体：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化反应的受体处于细胞内细胞内。胞内含有大量的ATP（即磷酸供体）。完全处于细胞外的蛋白质不受可逆磷酸化调节。蛋白磷酸酯酶的作用与蛋白激酶相反。这个酶能够将蛋白连接的磷酸基团水解，再生出侧链含有羟基的氨基酸残基，并释放磷酸。这些酶在细胞内的功能也很重要，因为它们能够关闭激酶活化的信号途径。一类高度保守的磷酸酯酶是PP2A，能够阻遏受癌促进的一些激酶活性。在生理条件下磷酸化和去磷酸化反应不可逆。特定蛋白质的磷酸化必需相应的蛋白激酶并消耗ATP。脱磷酸化反应只要相应的蛋白磷酸酯酶催化，无需能量。因此目标蛋白的磷酸化和去磷酸化反应得方向是单一的。磷酸化、去磷酸化转换的速度

18、取决于激酶和磷酸酯酶活性的相对大小。磷酸化是控制酶蛋白活性的有效方式，理由如下：1. 磷酸基团修饰蛋白质，使蛋白质增加两个负电荷。破坏没有修饰蛋白质间的静电相互作用，建立新的静电作用。显著改变酶蛋白的底物结合性和催化活性。2. 磷酸基团能形成三个或更多的氢键。磷原子四面体几何形状使之具有很高的方向性，能够与氢键供体形成特异的相互作用。3. 磷酸化的自由能很大。ATP提供了-50kJ mol-1，大约一半的能量用于驱动蛋白质磷酸化反应。另一半能量储存在磷酸化蛋白中。蛋白磷酸化反应不可逆。自由能变化5.69 kJ mol-1能够使反应平衡增加10倍，因此消耗ATP的磷酸化反应能够使反应平衡增加10

19、4倍。 4. 磷酰化和去磷酰化反应可以在1秒内完成，也可以在几小时内完成。这些可以调控以满足生理需求。5. 磷酸化反应常常有很高的放大效应。一个磷酸化的激酶短期内能够使几百个目标蛋白磷酸化。如果目标蛋白是酶分子，后者将能转化大量的底物分子。6. ATP是细胞内能源分子（15章）。利用这个化合物作为磷酸供体能够将细胞的能量状态和代谢调控联系起来。蛋白激酶的特异性不同，有的只能磷酸化一种或密切相关的几种蛋白质。多功能蛋白激酶能够磷酸化很多种蛋白质，涉及很多生物过程。此时将许多蛋白底物磷酸化位点的序列比较，显示多功能蛋白激酶的识别序列相关。蛋白激酶A识别的共有序列是Arg-Arg-X-Ser（Thr

20、）-Z, 其中X是小氨基酸，Z是大的疏水性氨基酸，Ser或Thr是磷酸化位点。但是，Lys替代Arg也可充当底物，只是蛋白底物与酶的亲和性稍微偏低。含有共有序列的合成多肽几乎总能为丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶磷酸化。因此磷酸化位点附近的氨基酸序列是蛋白激酶A特异性的主要决定因素。但是，远距离的氨基酸残基对底物特异性也有贡献，使酶分子易于或难于进入相应的磷酸化位点。蛋白酶A的活化需要cAMP每条R链都有一段Arg-Arg-Gly-Ala-Ile序列，这段序列与PKA酶促反应的磷酸化位点序列几乎相同，只是将Ser用Ala替代。因此调节亚基是假底物，能够占据催化亚基的活性位点（但是不能被磷酸化），阻止真正

21、的底物蛋白与活性位点结合（图10.17）。cAMP与R链结合发生结构变化（变构），使假底物从活性位点脱下。释放出来的催化链能结合底物并使后者磷酸化。 抑制肽与PKA催化亚基复合物。催化亚基有350个氨基酸，构成两个叶(lobes)。ATP和抑制肽结合于两两叶之间的狭缝叶之间的狭缝中。小叶与ATP-Mg2+接触多。大叶与多肽抑制剂接触多。大叶提供了催化活性的关键残基。底物结合后两叶相互两叶相互靠近靠近。限制两叶相互靠近能控制酶活性。所有已知的蛋白激酶都有第40到 280位氨基酸残基构成的保守催化核。为了磷酸化不同蛋白质，进化过程中多次使用同一生化策略。占据活性位点的抑制剂含有Arg-Arg-As

22、n-Ala-Ile序列（图10.19）。第一个精氨酸的胍基与酶蛋白Glu127的羧基形成离子对。第二个精氨酸与其他羧基形成离子对。假底物的非极性异亮氨酸（Z）与酶分子构成疏水沟的两个亮氨酸紧密结合。图图10.19 假底物与蛋白激酶假底物与蛋白激酶A的结合。的结合。抑制剂与酶分子有多个接触点。两个Arg的侧链与酶分子三个谷氨酸侧链形成盐桥。疏水氨基酸残基在底物识别过程中也很重要。假底物的异亮氨酸残基与酶分子的两个亮氨酸残基接触。肽键断裂活化酶原或蛋白质前体1. 消化酶在胃和胰脏是酶原的形式合成的。2. 血液的凝固是蛋白酶原活化的级联反应，能够对创伤应答迅速、放大。3. 有些蛋白激素合成的初级产物

23、是没有活性的前体。水解删除一段肽链，才能将胰岛素前体转化成胰岛素4. 构成皮肤、骨的纤维蛋白胶原，来自胶原蛋白前体。胶原蛋白前体是可溶的。5. 很多发育过程由酶原活化控制。例如，蝌蚪形变成青蛙，几天之内就将尾巴德胶原蛋白吸收（如同哺乳动物生产后降解子宫胶原蛋白）。胶原蛋白酶前体活化成胶原蛋白酶的时间非常精确，实现组织重构。6. 程序化死亡或细胞凋亡是caspase蛋白酶介导的。从线虫到人类，caspases一旦活化就能启动细胞死亡。细胞凋亡给生物体提供了重构发育过程中生物体形态、清除受到感染或损伤的细胞的一种途径。胰凝乳蛋白酶的前体是没有活性的胰凝乳蛋白酶原，在胰脏合成（其他几种酶原和消化酶也

24、是在胰脏合成）。胰脏是合成和分泌蛋白质最活跃的器官，胰脏的acinar细胞合成酶和酶原，储存于用膜包裹的颗粒（membrane-bounded granules）内（图10.20）。酶原颗粒在acinar细胞的顶部积累。当细胞受到激素或神经脉冲刺激，便将颗粒内的物质释放到与十二指肠（duodenum）接通的管腔中。 图图10.20 胰脏胰脏acinar细胞分泌酶原。细胞分泌酶原。图图10.21 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶原的蛋白水解活化。原的蛋白水解活化。a-胰凝乳蛋白酶的三条多肽链用两个链间二硫键连接（A与B，和B与C）。1.新的N-端即Ile 16向内移动与Asp194形成离子键，启动一系列

25、构象变化。2.Met 192从深度包埋状态（在酶原分子）移动到活性酶分子表面，187位和193位氨基酸残基更为伸展。这些变化形成了针对芳香氨基酸和大的非极性氨基酸特异性底物结合位点。一边是189至192位氨基酸构成。酶原分子不能构建出底物结合位点的这一部分。3. 酶原缺氧负离子洞，胰凝乳蛋白酶有完整的氧负离子洞。4. 有些区域构象变化细微。因此，从无活性的蛋白质转化成有活性的蛋白质的结构变化是局部的、不连续的。这些变化是一个肽键断裂启动的。（1）胰蛋白酶原活化受内肽酶或自身酶催化。产生的结构变化范围大，产生四段多肽（相当于蛋白质分子的15%左右）。在酶原分子中几个区域构象可变，但是在胰蛋白酶分

26、子中构象稳定。（2）胰蛋白酶原的氧负离子洞距离His 57太远，无法促进四面体转化态的形成。排列在十二指肠上的细胞分泌内肽酶(enteropeptidase)。 胰脏的胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶抑制剂是一个6kD的蛋白质，与胰蛋白酶活性位点结合紧密，抑制胰蛋白酶活性。胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂复合物的解离常数是0.1 pM，相当于结合的标准自由能达到-75 kJ mol-1。用变性试剂如8M 尿素或6M 盐酸胍处理不能将这种复合物分开。这点几乎与所这点几乎与所有的蛋白质复合物不同。有的蛋白质复合物不同。 该复合物特别稳定。该抑制剂是非常有效的胰蛋白酶底物类似物。抑制剂占居胰蛋白酶活性位点。抑制剂1

27、5位赖氨酸与胰蛋白酶底物结合口袋的天冬氨酸侧链结合。胰蛋白酶主链和抑制剂主链之间形成了很多氢键。而且，抑制剂15位赖氨酸的羰基及其附近的原子与酶活性位点匹配紧密。比较与酶结合的抑制剂结构和没有与酶结合的抑制剂结构发现，酶蛋白与抑制剂结合几乎没有发生结构变化（图10.24）。因此这个抑制剂是预先做好的、与胰蛋白酶完全匹配的抑制剂。胰蛋白酶催化断裂抑制剂15位的赖氨酸和16位的丙氨酸之间的肽键非常慢：半寿期是几个月。本质上，胰蛋白酶抑制剂就是胰蛋白酶的底物，但是这个底物与酶活性位点匹配得太完美以致酶的活性位点与这个底物结合太紧，导致转化速度太慢。图图10.24 胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂之间的相互作

28、用。胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂之间的相互作用。胰蛋白酶（黄色）与胰蛋白酶抑制剂（红色）形成的复合物结构。抑制剂15位的赖氨酸插入酶活性位点，与酶活性位点的Asp189形成盐键。结合抑制剂和游离抑制剂的结构几乎一致。胰蛋白酶量比抑制剂量大得多。为什么还要抑制剂？1. 胰蛋白酶能够活化其他酶原。因此阻止不当活化产生的少量胰蛋白酶活性是非常重要的。在胰脏或胰腺管，用抑制剂阻止胰蛋白酶活性，阻止酶活化对器官的伤害。否则会导致胰腺炎。2. a1-抗胰蛋白酶是嗜中性白细胞分泌的、大小为53kD的血浆蛋白，能够保护组织免受弹性蛋白酶水解。嗜中性白细胞能吞噬细菌。该抑制剂对弹性蛋白酶抑制效率比它对胰蛋白酶活性的

29、抑制效率高得多，因此称之为抗弹性蛋白酶（anti-elastase）更准确。a1-抗胰蛋白酶与酶蛋白活性位点结合几乎不可逆，抑制弹性蛋白酶。a1-抗胰蛋白酶Z突变体的53位赖氨酸变成谷氨酰胺，抑制剂从肝脏向外分泌速度慢，血清抑制剂的水平相当于正常纯合子水平的15%左右，导致血清弹性蛋白酶水平过高，后者水解弹性纤维和其它组织粘连蛋白，导致肺泡（alveolar）壁受损（肺气肿）。吸烟能够氧化这个抑制剂358位的甲硫氨酸（图10.25）。358位甲硫氨酸是这个抑制剂与弹性蛋白酶结合所必需的氨基酸，它就是弹性蛋白酶结合这个抑制剂的诱饵诱饵。但是，甲硫氨酸的氧化产物不能诱导弹性蛋白酶。看，一个氧原子加

30、入就彻底改变了这个蛋白质的生物化学行为。10.26 血液凝固的级联反血液凝固的级联反应。应。内在的、外在的、和最后共同的途径互作，形成纤维凝血快。内在途径从XII因子活化开始。XII因子与损伤产生的异常表面接触产生活化。外在途径由创伤启动。创伤释放组织因子(TF)。TF与VII因子形成复合物，活化凝血酶，启动凝血反应。无活性的凝血因子用红色标出，相应的活化成分后面添加下标字母a，用黄色标出。刺激蛋白不是自身的，用蓝色框出。一个凝血因子的活化形式是下一个凝血因子活化的酶。级联反应最后一步是凝血酶催化将纤维蛋白原转化成纤维蛋白。纤维蛋白原是6条多肽链组成的340kD蛋白质。三个球状单位为两个棒状单

31、位连接起来。Aa，Bb，和g链各有两条。棒状单位是三条多肽链构成的a-螺旋的螺旋。a-螺旋的螺旋是蛋白质分子中重复出现的结构域。凝血酶酶切纤维蛋白原中央球部区域的4个Arg-Gly肽键。每条Bb多肽链释放一条二十肽，每条Aa链释放一条十八肽。这些A肽和B肽称为纤维蛋白肽。缺乏纤维蛋白肽的纤维蛋白原分子叫纤维蛋白单体，有亚单位结构(abg)2。 图图10.29 纤维蛋白凝块的形成。纤维蛋白凝块的形成。（1）凝血酶酶切纤维蛋白原中央球区域，释放纤维蛋白肽A和B。b-和g-链C-端的球状区域分别与b-和g-链新生的N-端钮扣相互作用，形成凝血块。图图10.28 纤维蛋白的电子显微图谱。纤维蛋白的电子

32、显微图谱。沿纤维轴，每23nm出现一个重复，相当于纤维蛋白原分子长度的一半。这种交联反应受转谷氨酰胺酶的催化。转谷氨酰胺酶就是有活性的凝血因子XIIIa。XIII因子前体（即转谷氨酰胺酶前体）受凝血酶催化。凝血酶基因的直接产物是凝血酶原，没有活性，有四个主要的结构域。N-端结构域是gla结构域，富含g-羧基谷氨酸。第二个和第三个结构域是Kringle结构域。C端结构域是丝氨酸蛋白酶结构域。这些结构域协同作用，保证凝血酶原处于无活性状态，并能够将凝血酶原递送到适当位点用Xa因子（丝氨酸蛋白酶）和Va因子(刺激蛋白)活化。凝血酶活化的起始是蛋白酶水解274位和275位氨基酸之间的肽键，释放N-端的

33、三个结构域。Arg323-Ile324之间肽键（类似于胰凝乳蛋白酶原的关键肽键）的断裂产生有活性的凝血酶。已知凝血酶和其他因子的合成需要维生素K这一事实有多年。缺乏维生素K凝血有缺陷（koagulation是北欧的拼写）。研究结果显示，维生素K缺乏或者有维生素K的拮抗剂存在时，凝血酶前体合成异常，揭示维生素K的作用模式。双香豆醇（dicoumarol）出现于腐败三叶草，小牛食入这样的干草患致命的出血病(hemorrhagic disease)。临床上用这类双香豆素衍生物作为抗凝剂，治疗血栓。双香豆醇和相关的维生素K拮抗剂如warfarin用作杀鼠剂。牛摄入双香豆醇合成的凝血酶前体不能结合Ca2

34、+，而正常的凝血酶前体能够结合Ca2+。这个现象困扰多年，因为异常的凝血酶前体与正常的凝血酶前体氨基酸组成、水解后氨基酸分析得结果都完全相同。凝血酶前体gla结构域的g-羧基谷氨酸的合成依赖维生素K，催化这个反应的酶是依赖于维生素K的羧化酶。杀鼠灵双香豆醇凝血酶前体能够与Ca2+结合。但是结合Ca2+有什么作用？损伤后，Ca2+结合能够将凝血酶前体锚定在血小板磷脂双层膜表面。这一步很关键，使凝血酶原到达两个血凝蛋白附近，后者将凝血酶原转化成凝血酶。删除Ca2+结合域，从膜上释放凝血酶，使之能够酶切纤维蛋白原和其他目标蛋白。 血友病揭示凝血过程的早期反应血友病揭示凝血过程的早期反应 在阐明凝血途

35、径方面很多重要的突破源于对出血疾病的研究。经典的血友病，或血友病A，是大家熟知的凝血缺陷疾病，是性连锁隐性遗传疾病。经典的血友病，没有内在途径的VIII因子（抗血友病因子）或者这个因子的含量非常低。尽管VIII因子自身不是蛋白酶，但是它能显著促进X因子的活化。X因子活化的催化酶是IXa（一种丝氨酸蛋白酶）（图10.33）。因此血友病的内在凝血途径严重受损。 过去输入含有VIII因子的浓缩血浆治疗血友病。这种治疗技术有感染的风险。实际上很多血友病患者有肝炎或最近流行的AIDS病。需要发展更为安全的VIII因子治疗试剂。采用生物化学纯化和DNA重组技术，用培养细胞表达VIII因子。现在治疗血友病多

36、用重组VIII因子，很少用血浆纯化的VIII因子。图图10.33 抗血友病因子（即抗血友病因子（即VIII因子）的作用。因子）的作用。抗血友病因子（即VIII因子）促进IXa因子催化的X因子的活化。凝血酶限制性酶切VIII因子能显著增加VIII因子活性。一旦达到一定的阈值，这个正反馈能放大凝血信号，加速凝血过程。凝血必须迅速，局限于受伤区域。凝血区域局限于损伤位点的机制是什么？ 凝血因子的不稳定性有助于凝血控制。由于血液流动稀释迅速、肝脏清除、蛋白酶降解等原因，活化的凝血因子寿命短。例如蛋白酶C能够降解Va和VIIIa。蛋白酶C是凝血酶活化的蛋白酶。因此凝血酶有双重活性，即催化纤维蛋白形成，启动凝血级联反应途径销毁。凝血因子的特殊抑制剂也是终止凝血过程所必需的。例如，组织因子途径抑制剂（TFPI）抑制TF-VIIa-Xa复合物，TFPI独立的结构域能够抑制VIIa和Xa。另一个关键的抑制剂是抗凝血因子抗