基因工程操作程序

1、 基因工程的基本操作程序苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因毒蛋白基因苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌棉花细胞棉花细胞 基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定一、一、目的目的基因基因的获取的获取主要是主要是编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因获取方法：获取方法：1、从基因文库中获取目的基因、从基因

2、文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成外显子内含子与RNA聚合酶结合位点编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点编码区原核生物基因原核生物基因真核生物基因真核生物基因补充补充:1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为同基因，称为基因文库基因文库。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部

3、分基因文库(CDNA文库文库)某生物体内某生物体内全部全部DNADNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因限制酶限制酶与运载体连接与运载体连接 导入导入基因组文库基因组文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNAcDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接与运载体连接 导入导入部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）概念：概念：原理：原理：PCRPCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术片段的核酸合成技术 。

4、体外体外DNADNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。根据这一序列合成引物。（1 1）模板）模板DNADNA( ( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) （2 2）四种脱氧核苷酸）四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP) （3 3）耐高温的）耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、通过、通过DNA合成仪用化学方法人工合成合成仪用化学方法人工合成推推测测推推测测合合成成 当当基因比较小基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷核苷酸

5、序列已知酸序列已知时，可采用此种方法。时，可采用此种方法。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建-核心核心基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标志基因标志基因基因表达载体的组成三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和

6、动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2.2.将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞显微注射技术显微注射技术3.3.将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞Ca2+处理处理1.1.将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞农杆菌转化法：农杆菌转化法：显微注射技显微注射技术术提纯基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受

7、精卵移植2.2.将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插上是否插入了目的基因入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗原抗体杂交抗体杂交基因探针：目的基因片段用放射性同位素标记基因探针：目的基因片段用放射性同位素标记基基因因工工

8、程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成复制原点复制原点 + + 目的基因目的基因 + + 启动子启动子 + + 终止子终止子 + + 标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技

9、术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定巩固练习巩固练习:1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该该抗性基因的主要作用是抗性基因的主要作用是 ( )A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接便于与外源基因连接2.在遗传工程技术中在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于限制性内切酶主要用于 ( )A.目

10、的基因的提取和导入目的基因的提取和导入B.目的基因的提取和检测目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合目的基因的提取与载体结合BD3.在遗传工程技术中在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得离的方法获得 ( )A.人的胰岛素基因人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因菜豆储藏蛋白基因4.1976年年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达并获得了表达,此文中的此文中的表达是指该基因在大肠杆菌表达是指该基因在大肠杆菌 ( )A.能进行能进行DNA复制复制B.能