第2章 沉淀法

1、2022-5-291第二章第二章 沉淀法沉淀法Precipitation Precipitation Principle and MethodsPrinciple and Methods2022-5-29海南大学农学院wss2沉淀的概念沉淀的概念 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 在制备过程中采用沉淀的手段在制备过程中采用沉淀的手段: : 主要是为了达到浓缩的目的，或者通过沉淀固主要是为了达到浓缩的目的，或者通过沉淀固液分相后除去留在液相或沉积在固体中的非必要成份；液分相后除去留在液相或沉积在固体中的非必要成份； 其次，沉淀可以将已粗提取

2、物由液态变成固态其次，沉淀可以将已粗提取物由液态变成固态加以保存或进一步处理。加以保存或进一步处理。 沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成份。地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成份。2022-5-29海南大学农学院wss3内容提要内容提要 第一节第一节 沉淀法的基本原理沉淀法的基本原理第二节第二节 沉淀的类型与操作沉淀的类型与操作 第三节第三节 应用实例应用实例2022-5-29海南大学农学院wss4第一节第一节 沉淀法的基本原理沉淀法的基本原理n沉淀法也称溶解度法。沉淀法也称溶解度法。n根据各种物质的结构差异来改变溶液的

3、某些根据各种物质的结构差异来改变溶液的某些性质，导致抽提液中有效成分的溶解度发生性质，导致抽提液中有效成分的溶解度发生变化。变化。2022-5-29海南大学农学院wss5 蛋白质：蛋白质： 组织提取物是蛋白质与其他可溶于提取缓冲液的组织提取物是蛋白质与其他可溶于提取缓冲液的复杂混合物。复杂混合物。此提取物通常含有较高的总蛋白浓度，此提取物通常含有较高的总蛋白浓度，各组分的结构差异性，有可能通过改变缓冲液的组各组分的结构差异性，有可能通过改变缓冲液的组成或性质，成或性质，利用蛋白质在不同条件下的溶解度差异利用蛋白质在不同条件下的溶解度差异及溶液中的高蛋白浓度，使之在短时间内形成蛋白及溶液中的高蛋

4、白浓度，使之在短时间内形成蛋白质聚集物。质聚集物。一组蛋白质的沉淀便可通过低速离心而一组蛋白质的沉淀便可通过低速离心而与其他仍留在溶液中的蛋白质分开。若被研究的活与其他仍留在溶液中的蛋白质分开。若被研究的活性与其中一组（上清或沉淀）蛋白质有定量关系，性与其中一组（上清或沉淀）蛋白质有定量关系，则比活性应增加。则比活性应增加。 2022-5-29海南大学农学院wss6A.A.混合样品；混合样品；B.B.加入中性盐或其他沉淀剂；加入中性盐或其他沉淀剂；C.D.C.D.有效成份沉淀，杂质溶解；或相反。样品浓缩、有效成份沉淀，杂质溶解；或相反。样品浓缩、体积变小；通过离心将目的蛋白质分离。体积变小；通

5、过离心将目的蛋白质分离。A B C D2022-5-29海南大学农学院wss7内容提要内容提要 第一节第一节 沉淀法的基本原理沉淀法的基本原理第二节第二节 沉淀的类型与操作沉淀的类型与操作 第三节第三节 应用实例应用实例2022-5-29海南大学农学院wss8第二节第二节 沉淀的类型与操作沉淀的类型与操作沉淀理论沉淀理论 1)1)盐溶与盐析现象；盐溶与盐析现象；2)2)取消蛋白质表面的电取消蛋白质表面的电荷和水化膜；荷和水化膜；3)3)蛋白质表面疏水补丁蛋白质表面疏水补丁的结合现象。的结合现象。2022-5-29海南大学农学院wss9影响因素影响因素1 1）总蛋白浓度必须足够高以快速产生聚集体

6、和最终）总蛋白浓度必须足够高以快速产生聚集体和最终沉淀物；沉淀物；2 2）在沉淀过程中，待研究的蛋白质的活性必须得到）在沉淀过程中，待研究的蛋白质的活性必须得到保护，而不是变性的沉淀；保护，而不是变性的沉淀；（变性沉淀是指蛋白质（变性沉淀是指蛋白质在解折叠时曝露其核心的疏水部分，而非疏水的表在解折叠时曝露其核心的疏水部分，而非疏水的表面。）面。）3 3）pH pH 能影响沉淀及活性，因其表面电荷随能影响沉淀及活性，因其表面电荷随 pH pH 的变的变化而改变；化而改变；4 4）温度能影响沉淀，为使蛋白质保持活性而蛋白水）温度能影响沉淀，为使蛋白质保持活性而蛋白水解又最少，常取解又最少，常取44

7、进行。进行。2022-5-29海南大学农学院wss10常用的沉淀方法和沉淀剂常用的沉淀方法和沉淀剂1)1)盐析法：盐析法：选用中性盐为沉淀剂，多用于各种蛋白选用中性盐为沉淀剂，多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。质和酶的分离纯化。2)2)等电点沉淀法：等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质及其他两性用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但单独应用较少，多与其他方法结物质的沉淀，但单独应用较少，多与其他方法结合使用。合使用。3)3)有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。酸类产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。202

8、2-5-29海南大学农学院wss114)4)非离子多聚体沉淀法：非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分用于分离生物大分子。子。5)5)生成盐复合物沉淀：生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特用于多种化合物，特别是某些小分子物质的沉淀。别是某些小分子物质的沉淀。6)6)热变性及酸碱变性沉淀法：热变性及酸碱变性沉淀法：即选择性变性即选择性变性沉淀。在分离制备时，选择性的用于除去沉淀。在分离制备时，选择性的用于除去某些不耐热及在一定某些不耐热及在一定pHpH值下易变性的杂蛋值下易变性的杂蛋白。白。2022-5-29海南大学农学院wss12一、一、 盐析法盐析法 盐析的定义：盐析的定义：许多生物物质如蛋白

9、质、许多生物物质如蛋白质、多肽、多糖、核酸、病毒等都可以在溶液多肽、多糖、核酸、病毒等都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程称为中加入中性盐而沉淀析出，这一过程称为“盐析盐析”。2022-5-29海南大学农学院wss13盐析的原理盐析的原理n蛋白质在稀盐溶液中的溶解度是随着盐浓度的增加蛋白质在稀盐溶液中的溶解度是随着盐浓度的增加而增加的，主要是而增加的，主要是中性盐离子对蛋白质复杂表面极中性盐离子对蛋白质复杂表面极性基团及水活度性基团及水活度的影响，增加了蛋白质分子与溶剂的影响，增加了蛋白质分子与溶剂分子相互作用力，使蛋白质的溶解度增大。分子相互作用力，使蛋白质的溶解度增大。但但中性中性

10、盐的浓度增加到一定程度时，水分子在中性盐的作盐的浓度增加到一定程度时，水分子在中性盐的作用下用下活度大大降低活度大大降低，蛋白质表面电荷大量被中和，蛋白质表面电荷大量被中和，最后破坏了蛋白质外表的最后破坏了蛋白质外表的水化膜水化膜，同时这些离子所同时这些离子所带的电荷，也能削弱蛋白质分子所带的电荷，即带的电荷，也能削弱蛋白质分子所带的电荷，即无无机盐可消除稳定蛋白质胶体稳定存在的两个因素，机盐可消除稳定蛋白质胶体稳定存在的两个因素，而使蛋白质分子而使蛋白质分子之间相互之间相互聚集而沉淀。聚集而沉淀。2022-5-29海南大学农学院wss14水水化化膜膜2022-5-29海南大学农学院wss15

11、水化膜水化膜（clathrate cages of water molecule form）2022-5-29海南大学农学院wss16盐析法的优缺点盐析法的优缺点n成本低，不需要特别昂贵的仪器设备。成本低，不需要特别昂贵的仪器设备。n操作简单，安全。操作简单，安全。n对许多生物活性物质具有稳定作用。对许多生物活性物质具有稳定作用。n对溶液中分离物的总浓度要求（对溶液中分离物的总浓度要求（2mg/ml2mg/ml）。）。n由于发生共沉淀现象，故分辨率不高。由于发生共沉淀现象，故分辨率不高。 2022-5-29海南大学农学院wss17盐析法的一般操作步骤：盐析法的一般操作步骤： 1)1)选择一定浓

12、度范围的盐溶液（如选择一定浓度范围的盐溶液（如0 02525饱和硫酸铵），饱和硫酸铵），使部分杂质呈使部分杂质呈“盐析，盐析，salting out”salting out”（沉淀）状态，（沉淀）状态，有效成分呈有效成分呈“盐溶，盐溶，salting in”salting in”（溶解）状态。（溶解）状态。2022-5-29海南大学农学院wss182022-5-29海南大学农学院wss192)2)经离心分离后得到上清液，再选择一定浓度范围的经离心分离后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐溶液（如盐溶液（如25256060饱和硫酸铵），使有效成分饱和硫酸铵），使有效成分等物质呈等物质呈“盐析盐析”

13、状态，而另一部分杂质呈状态，而另一部分杂质呈“盐溶盐溶”状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。成分物质。离心离心2022-5-29海南大学农学院wss20（一）盐分级沉淀（一）盐分级沉淀1.1.盐的选择盐的选择 硫酸铵是分级沉淀蛋白质的一种极有用的盐，具硫酸铵是分级沉淀蛋白质的一种极有用的盐，具有以下优点：有以下优点：n溶解度大，对温度不敏感，故在温差较大时，其溶解度大，对温度不敏感，故在温差较大时，其溶解度改变较小。溶解度改变较小。n分级效果好，利于除去大量的杂蛋白。分级效果好，利于除去大量的杂蛋白。n稳定性好，在高盐低温时对蛋白质

14、的结构有稳定稳定性好，在高盐低温时对蛋白质的结构有稳定作用。作用。n价格低廉，大量使用时比较经济，故适用范围较价格低廉，大量使用时比较经济，故适用范围较宽。宽。2022-5-29海南大学农学院wss212.2.硫酸铵的饱和度及调整法硫酸铵的饱和度及调整法 盐析时硫酸铵的浓度常用饱和盐析时硫酸铵的浓度常用饱和度表示。即：用饱和硫酸铵溶液浓度表示。即：用饱和硫酸铵溶液浓度（在度（在2323下为下为4.1mol/L4.1mol/L）的百分）的百分数来表示它的浓度，而不用其实际数来表示它的浓度，而不用其实际的克分子浓度来表示。的克分子浓度来表示。2022-5-29海南大学农学院wss22* *饱和度概

15、念：饱和度概念：每升溶剂可溶解盐的量每升溶剂可溶解盐的量（克）。（克）。* 饱和硫酸铵的配制在饱和硫酸铵的配制在1 1升水中加入硫酸铵的升水中加入硫酸铵的量达到量达到100100饱和度时，总体积为饱和度时，总体积为1.42L,1.42L,克克分子浓度为分子浓度为4.1M/L4.1M/L。即在。即在1 1升水中含硫酸铵升水中含硫酸铵的量的量g g M Mm mV =4.1V =4.1132 132 1.42=768g1.42=768g （4.1 4.1 132 132 1 1541g541g表示表示1L1L溶液中所溶液中所含硫酸铵的量）。根据工作表和经验公式计含硫酸铵的量）。根据工作表和经验公式

16、计算某一蛋白质溶液的硫酸铵饱和度时加入的算某一蛋白质溶液的硫酸铵饱和度时加入的量。量。2022-5-29海南大学农学院wss23当盐析要求不同的硫酸铵饱和度时用以下方法调当盐析要求不同的硫酸铵饱和度时用以下方法调整。整。nA.A.加入固体盐法：加入固体盐法：当盐析要求饱和度较高而又当盐析要求饱和度较高而又不增大溶液体积时，选用此法。操作时将硫酸不增大溶液体积时，选用此法。操作时将硫酸铵磨碎均匀，边搅拌边缓慢加入。据不同饱和铵磨碎均匀，边搅拌边缓慢加入。据不同饱和度加入硫酸铵的量从工作表中查得，或用经验度加入硫酸铵的量从工作表中查得，或用经验公式计算。公式计算。2022-5-29海南大学农学院w

17、ss242022-5-29海南大学农学院wss25需加入的硫酸铵的数量，用下列公式计算：需加入的硫酸铵的数量，用下列公式计算：533 (S2 - S1)g = 100 - 0.3S2541 (S2 - S1)g = 100 - 0.3S2（20）（25）S S2 2表示要求达到的百分饱和度；表示要求达到的百分饱和度；S S1 1表示原溶液中的百分饱和度。表示原溶液中的百分饱和度。2022-5-29海南大学农学院wss26nB.B.加入饱和溶液法：加入饱和溶液法： 适合于要求饱和度不高，而且原溶液体积适合于要求饱和度不高，而且原溶液体积不大时使用。但对体积的影响较大，在操作不大时使用。但对体积的

18、影响较大，在操作时仍应缓慢加入，以免局部过浓，影响分离时仍应缓慢加入，以免局部过浓，影响分离效果。效果。 S2 - S1V = V0 S3 S22022-5-29海南大学农学院wss27nC.C.透析平衡法：透析平衡法：将需影响的样品置透析袋将需影响的样品置透析袋中，浸入饱和的硫酸铵溶液中进行透析，中，浸入饱和的硫酸铵溶液中进行透析，盐不断地进入透析袋内，逐步达到所需要盐不断地进入透析袋内，逐步达到所需要的盐析饱和度，使蛋白质产生沉淀，即停的盐析饱和度，使蛋白质产生沉淀，即停止透析。其盐的变化是连续性的，盐析效止透析。其盐的变化是连续性的，盐析效果较好。但计算饱和度的测定果较好。但计算饱和度的

19、测定 工作手续繁琐。工作手续繁琐。2022-5-29海南大学农学院wss28（二）制作盐析曲线（二）制作盐析曲线n硫酸铵硫酸铵“分馏分馏”法法：是逐级按递增的比例将是逐级按递增的比例将硫酸铵加入提取物，级间插入离心的步骤。硫酸铵加入提取物，级间插入离心的步骤。适合于对某个样品的沉淀范围不很确定，体适合于对某个样品的沉淀范围不很确定，体积较大时选用。积较大时选用。n分分6 61010次加入不同饱和度的硫酸铵。根据蛋次加入不同饱和度的硫酸铵。根据蛋白质在各分级的饱和度中的活性及含量绘制白质在各分级的饱和度中的活性及含量绘制盐析曲线，再制定出提高收得率和纯化倍数盐析曲线，再制定出提高收得率和纯化倍数

20、的精细盐析范围。的精细盐析范围。 2022-5-29海南大学农学院wss29加入加入20%20%上清加上清加入入20%20%上清再加入上清再加入20%20%蛋白质含量或活性蛋白质含量或活性盐的浓度盐的浓度0 20 40 60 80 10020406080100沉淀沉淀测测定定02022-5-29海南大学农学院wss30（二）制作盐析曲线（二）制作盐析曲线n硫酸铵硫酸铵“分馏分馏”法法：是逐级按递增的比例将：是逐级按递增的比例将硫酸铵加入提取物，级间插入离心的步骤。硫酸铵加入提取物，级间插入离心的步骤。适合于对某个样品的沉淀范围不很确定，体适合于对某个样品的沉淀范围不很确定，体积较大时选用。积较

21、大时选用。n分分6 61010次加入不同饱和度的硫酸铵。根据蛋次加入不同饱和度的硫酸铵。根据蛋白质在各分级的饱和度中的活性及含量绘制白质在各分级的饱和度中的活性及含量绘制盐析曲线盐析曲线，再制定出提高收得率和纯化倍数，再制定出提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。的精细盐析范围。 2022-5-29海南大学农学院wss31硫酸铵沉淀蛋白质抽提液图示硫酸铵沉淀蛋白质抽提液图示100%100%饱和度饱和度时的溶质量时的溶质量蛋蛋白白质质沉沉淀淀/% 20 40 60 80 10020 40 60 80 1002040硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度/%/%2022-5-29海南大学农学院wss32硫酸铵的分

22、级试验硫酸铵的分级试验批次批次百分饱和度百分饱和度范围范围酶沉淀酶沉淀 蛋白沉淀蛋白沉淀 纯化倍数纯化倍数备注备注第一次第一次0 040404 42525酶在酶在40-60%40-60%盐中沉盐中沉淀比淀比60-80%60-80%多多40406060626222222.82.860608080323232321.01.0第二次第二次0 045456 63232酶在酶在45-70%45-70%盐中沉盐中沉淀率高，但纯化淀率高，但纯化45457070909038382.42.4倍数倍数 第一次第一次40-40-60%60%提取纯度提取纯度第三次第三次0 0484810103535要改试第三次要改试

23、第三次48-48-65%65%盐饱和度盐饱和度48486565757525253.03.02022-5-29海南大学农学院wss33（三）分级分离的结果（三）分级分离的结果n所需蛋白质可在一分级的硫酸铵浓度下所需蛋白质可在一分级的硫酸铵浓度下沉淀，使之有可能极大地提高比活性。沉淀，使之有可能极大地提高比活性。n能在一较宽的能在一较宽的“馏分馏分”内沉淀出待研究内沉淀出待研究的蛋白质，比活性得到颇为满意的提高，的蛋白质，比活性得到颇为满意的提高，去除了许多杂蛋白。去除了许多杂蛋白。n若所需蛋白在某组条件下高度可溶，能若所需蛋白在某组条件下高度可溶，能除去大部分杂蛋白，所需蛋白质则保留除去大部分杂

24、蛋白，所需蛋白质则保留于上清中。于上清中。2022-5-29海南大学农学院wss34（四）盐析时需注意的问题（四）盐析时需注意的问题1.1.加固体硫酸铵时，应注意工作表上注明加固体硫酸铵时，应注意工作表上注明的温度，的温度，00或室温（或室温（20202525），加入），加入固体盐后体积的变化已考虑在表中。例固体盐后体积的变化已考虑在表中。例在室温时在室温时S1=0S1=0，要求达到，要求达到S2S2100100饱和饱和度，每升溶液加固体硫酸铵度，每升溶液加固体硫酸铵767767克，若使克，若使S2=50S2=50饱和度时加入的量并非上述的饱和度时加入的量并非上述的1/21/2。2022-5-

25、29海南大学农学院wss352.2.分级盐析时，应考虑每次分级后蛋白质浓度的分级盐析时，应考虑每次分级后蛋白质浓度的变化，蛋白质浓度不同要求盐析的饱和度也不变化，蛋白质浓度不同要求盐析的饱和度也不同。同。3.3.为保证实验的重复性，应严格控制盐析条件的为保证实验的重复性，应严格控制盐析条件的pHpH、温度和盐的纯度。、温度和盐的纯度。4.4.盐析后需静置盐析后需静置1 1小时以上沉淀完全后才进行过小时以上沉淀完全后才进行过滤或离心。滤或离心。5.5.盐析时的搅拌必须是有规则的和温和的。盐析时的搅拌必须是有规则的和温和的。6.6.为平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉为平衡硫酸铵溶解时产生的轻

26、微酸化作用，沉淀反应至少应在淀反应至少应在50 mmol50 mmol/L/L缓冲液中进行。缓冲液中进行。2022-5-29海南大学农学院wss36（五）（五）盐析的影响因子盐析的影响因子n盐析常数（盐析常数（K KS S) )n盐分级范围的差异性盐分级范围的差异性npHpH和盐浓度和盐浓度n蛋白质的纯度和浓度蛋白质的纯度和浓度n其他其他2022-5-29海南大学农学院wss371.盐析常数盐析常数K Ks s： 蛋白质在盐析过程中其溶蛋白质在盐析过程中其溶解度与盐浓度之间存在一定的关系。解度与盐浓度之间存在一定的关系。 lgSlgS=-Ks=-KsM M K Ks s值大，表示有效成份溶解度

27、降低的速度值大，表示有效成份溶解度降低的速度是随着盐浓度的增加而快速降低，因此，是随着盐浓度的增加而快速降低，因此，K Ks s 值越大值越大, ,分级范围越窄分级范围越窄, ,盐析效果越好。盐析效果越好。而且每一种蛋白质的而且每一种蛋白质的K Ks s值会有大、小之分。值会有大、小之分。或者有盐析范围的差异。或者有盐析范围的差异。2022-5-29海南大学农学院wss38 30 40 50 60 70 80 90 A B C沉淀量沉淀量/mg/mg硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度/ /2.2.盐分级范围的差异性盐分级范围的差异性与蛋白质的盐析分离效果与蛋白质的盐析分离效果2022-5-29海南大学农

28、学院wss393.pH3.pH和盐浓度和盐浓度在在pIpI附近可用合适的盐浓度改变蛋白质的溶解度。附近可用合适的盐浓度改变蛋白质的溶解度。4.4.蛋白质的纯度和浓度蛋白质的纯度和浓度蛋白质存在的形式（蛋白质存在的形式（均一的还是混合的均一的还是混合的）和浓度不）和浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。同，盐析范围和溶解度也不同。蛋白质浓度高时共沉淀明显，盐析效果差。蛋白质浓度高时共沉淀明显，盐析效果差。一般控制样品液蛋白浓度在一般控制样品液蛋白浓度在0.2%0.2%2 2为宜。为宜。5.5.其他：其他： 如如 EDTAEDTA、EGTAEGTA等金属离子螯合剂等金属离子螯合剂; ; 时间时间长短的

29、控制。长短的控制。 2022-5-29海南大学农学院wss40（六）脱盐（六）脱盐方法：凝胶过滤法方法：凝胶过滤法 透析法透析法n透析法的原理透析法的原理是基于分子的扩散运动，具体操是基于分子的扩散运动，具体操作是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋，作是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋，扎紧袋口（袋内保留一定的空间），漂在水或扎紧袋口（袋内保留一定的空间），漂在水或适当的透析液中。适当的透析液中。要防止透析液从袋口进入，要防止透析液从袋口进入，以免引起透析袋胀裂以免引起透析袋胀裂。2022-5-29海南大学农学院wss41n盐离子和小分子物质将穿过半透膜由高向低进盐离子和小分子物质将穿过半透

30、膜由高向低进行扩散渗透，而大分子物质如蛋白质等则保留行扩散渗透，而大分子物质如蛋白质等则保留在袋内。在袋内。n为了加快透析脱盐的速度，应不断更换透析液，为了加快透析脱盐的速度，应不断更换透析液，若能配备搅动装置（温和搅动），脱盐的效果若能配备搅动装置（温和搅动），脱盐的效果则会更好。则会更好。n为了避免蛋白质或酶类的破坏，通常要求在低为了避免蛋白质或酶类的破坏，通常要求在低温下进行。温下进行。2022-5-29海南大学农学院wss422022-5-29海南大学农学院wss43二、等电点沉淀二、等电点沉淀n定义定义：蛋白质的等电点是指该蛋白质的静：蛋白质的等电点是指该蛋白质的静电荷为零时的电荷为

31、零时的pHpH值。蛋白质在此值。蛋白质在此pHpH时时, ,在水在水中的溶解度最低。由于总静电荷为零，溶中的溶解度最低。由于总静电荷为零，溶液系统的溶剂成份水会把蛋白质从本体溶液系统的溶剂成份水会把蛋白质从本体溶剂中排挤出来，使等电点相近及相同的蛋剂中排挤出来，使等电点相近及相同的蛋白质分子形成聚集体，蛋白质的这种相互白质分子形成聚集体，蛋白质的这种相互作用除了作用除了疏水表面疏水表面外，还有外，还有偶极对偶极对和和离子离子对对的相互作用。的相互作用。2022-5-29海南大学农学院wss44蛋白质在不同蛋白质在不同 pH pH 时盐析机理时盐析机理2022-5-29海南大学农学院wss45

32、三、有机溶剂沉淀法三、有机溶剂沉淀法n定义：定义：有机溶剂对许多能溶于水的小分子生有机溶剂对许多能溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。子都能发生沉淀作用。n其沉淀作用：其沉淀作用：1 1）脱水作用）脱水作用 ：降低水溶液的介电常数，溶质：降低水溶液的介电常数，溶质的溶解度减少。的溶解度减少。 2 2）改变溶剂的极性，离子基团趋向接近，使带）改变溶剂的极性，离子基团趋向接近，使带电溶质互相吸引聚集。电溶质互相吸引聚集。n沉淀剂：沉淀剂：甲醇、乙醇、丙酮等。甲醇、乙醇、丙酮等。2022-5-29海南大学农学院wss46有机

33、溶剂加入量的计算：有机溶剂加入量的计算： S2 - S1V = V0 100 S22022-5-29海南大学农学院wss47操作注意操作注意：1 1）低温操作，避免加有机溶剂时放热反应引起）低温操作，避免加有机溶剂时放热反应引起蛋白质变性。蛋白质变性。2 2）操作时辅加适量的中性盐，增加蛋白质的溶）操作时辅加适量的中性盐，增加蛋白质的溶解度解度, ,降低对蛋白质的变性作用降低对蛋白质的变性作用, ,以提高分级以提高分级效果。效果。3 3）多价阳离子）多价阳离子ZnZn2+2+和和CaCa2+2+在一定的在一定的pHpH值下能与值下能与呈阴离子的蛋白质形成复合物，其溶解度大呈阴离子的蛋白质形成复

34、合物，其溶解度大大降低，但不影响蛋白质的生物活性。大降低，但不影响蛋白质的生物活性。2022-5-29海南大学农学院wss48有机溶剂沉淀法的优缺点有机溶剂沉淀法的优缺点n分辨率高于盐析法，即一种蛋白质或其他溶质分辨率高于盐析法，即一种蛋白质或其他溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。n沉淀不用脱盐，过滤比较容易。沉淀不用脱盐，过滤比较容易。n在生化制备过程中应用比盐析法广。在生化制备过程中应用比盐析法广。n对某些活性要求较高的大分子，如酶，容易引对某些活性要求较高的大分子，如酶，容易引起变性失活，故对温度的要求严格。起变性失活，故对温度的要求

35、严格。2022-5-29海南大学农学院wss49四、蛋白质沉淀剂四、蛋白质沉淀剂n碱性蛋白质：碱性蛋白质：是含有较多碱性氨基酸的，是含有较多碱性氨基酸的，pIpI偏高的蛋白质，如鱼精蛋白与核酸、酸性蛋偏高的蛋白质，如鱼精蛋白与核酸、酸性蛋白进行不可逆的结合，可有效的除去这些杂白进行不可逆的结合，可有效的除去这些杂蛋白与核酸物质。蛋白与核酸物质。n凝集素：凝集素：对糖蛋白中糖链末端糖序列有特异对糖蛋白中糖链末端糖序列有特异的凝集作用。利用这一性质可以在条件温和，的凝集作用。利用这一性质可以在条件温和，专一性强地分离某种蛋白质。专一性强地分离某种蛋白质。n重金属盐重金属盐: :如铅盐、汞盐有时可与

36、蛋白质形成如铅盐、汞盐有时可与蛋白质形成复合物而用于沉淀蛋白质。复合物而用于沉淀蛋白质。2022-5-29海南大学农学院wss50五、非离子多聚物沉淀法五、非离子多聚物沉淀法n沉淀剂沉淀剂：聚乙二醇（：聚乙二醇（ polyethylene glycolpolyethylene glycol ，PEGPEG）, ,属非离子型聚合物。属非离子型聚合物。nPEGPEG亲水性强，有很广范围的分子量，在生亲水性强，有很广范围的分子量，在生化制备中用得较多的是化制备中用得较多的是PEG6000-20000PEG6000-20000。在。在使蛋白质沉淀时，条件温和，沉淀完全，使蛋白质沉淀时，条件温和，沉淀完

37、全，不引起蛋白质变性，应用较广。不引起蛋白质变性，应用较广。2022-5-29海南大学农学院wss51 作用机理假说：作用机理假说：n多聚物与大分子发生共沉淀作用。多聚物与大分子发生共沉淀作用。n多聚物使大分子在多聚物与水之间发生分配，多聚物使大分子在多聚物与水之间发生分配，使大分子脱水而沉淀。使大分子脱水而沉淀。n多聚物与大分子之间以氢键相互作用形成复多聚物与大分子之间以氢键相互作用形成复合物；或由于大分子被多聚物包埋形成复合物，合物；或由于大分子被多聚物包埋形成复合物，在重力作用下沉淀析出。在重力作用下沉淀析出。n最新理论认为：最新理论认为：是通过空间位置排斥，使液体是通过空间位置排斥，使

38、液体中的生物大分子被迫挤聚一起而引起沉淀的发中的生物大分子被迫挤聚一起而引起沉淀的发生。生。2022-5-29海南大学农学院wss52使用方法使用方法n选用二种水溶性非离子多聚物组成液选用二种水溶性非离子多聚物组成液液两相系统，使生物大分子在两相液两相系统，使生物大分子在两相中不等量分配，造成分离。中不等量分配，造成分离。n选用一种水溶性非离子多聚物，使生选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝集而沉淀析出相互凝集而沉淀析出。2022-5-29海南大学农学院wss53应用范围应用范围 分离细菌和病毒，选用葡聚糖聚乙二醇分离细菌和病毒

39、，选用葡聚糖聚乙二醇两相系统进行分级分离。两相系统进行分级分离。 沉淀核酸，选用葡聚糖聚乙二醇两相系沉淀核酸，选用葡聚糖聚乙二醇两相系统进行，或直接用聚乙二醇沉淀分离质粒统进行，或直接用聚乙二醇沉淀分离质粒DNADNA。 沉淀蛋白质与酶，用聚乙二醇沉淀分离纯沉淀蛋白质与酶，用聚乙二醇沉淀分离纯化免疫球蛋白、黄素蛋白乙醇氧化酶等成功化免疫球蛋白、黄素蛋白乙醇氧化酶等成功的例子。的例子。 2022-5-29海南大学农学院wss54六、选择性变性沉淀法六、选择性变性沉淀法n此方法的主要目的是破坏杂质，保护目的物此方法的主要目的是破坏杂质，保护目的物质。其原理是利用蛋白质、酶和核酸等生物质。其原理是利

40、用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理化学因素敏感性的差异选大分子对某些物理化学因素敏感性的差异选用适当的方法使杂蛋白变性沉淀，保留纯化用适当的方法使杂蛋白变性沉淀，保留纯化有效成份。有效成份。n方法：方法：n利用表面活性剂和有机溶剂引起变性。利用表面活性剂和有机溶剂引起变性。n利用对热的稳定性不同，加热破坏某些组利用对热的稳定性不同，加热破坏某些组分，保存另一些组分。分，保存另一些组分。n选择性的酸碱变性。选择性的酸碱变性。2022-5-29海南大学农学院wss55酵母干粉酵母干粉0.066 mol/L0.066 mol/L磷酸氢二钠磷酸氢二钠上清液上清液上清液（上清液（醇脱氢酶）醇脱氢酶

41、）3737水浴保温水浴保温2 h2 h，5555水浴保温水浴保温20 min20 min酵母菌细胞醇脱氢酶的纯化酵母菌细胞醇脱氢酶的纯化2022-5-29海南大学农学院wss56例例: :制备核酸制备核酸样品样品加入去污剂加入去污剂有机溶剂有机溶剂蛋白酶蛋白酶去蛋白去蛋白去多糖去多糖加入异丙醇加入异丙醇CTABCTAB在不同盐浓度在不同盐浓度中溶解度区别中溶解度区别沉淀核酸沉淀核酸DNADNA或或RNA RNA 有机溶剂有机溶剂2022-5-29海南大学农学院wss57样品样品盐析盐析 分级分离分级分离有机溶剂选择沉淀有机溶剂选择沉淀蛋白质沉淀蛋白质沉淀等电点沉淀等电点沉淀共沉淀去杂蛋白共沉淀

42、去杂蛋白依据蛋白质特性依据蛋白质特性沉淀有效成份沉淀有效成份碱性蛋白、碱性蛋白、凝集素、重金属凝集素、重金属沉淀或溶解蛋白质沉淀或溶解蛋白质选择变性条件去杂蛋白选择变性条件去杂蛋白2022-5-29海南大学农学院wss58内容提要内容提要 第一节第一节 沉淀法的基本原理沉淀法的基本原理第二节第二节 沉淀的类型与操作沉淀的类型与操作 第三节第三节 应用实例应用实例2022-5-29海南大学农学院wss59实例：磷酸二酯酶的纯化实例：磷酸二酯酶的纯化pH 6.0pH 6.0，硫酸铵，硫酸铵6565分级，沉淀分级，沉淀酶酶第二次硫酸铵沉淀第二次硫酸铵沉淀55 555 5分钟热变性杂蛋白分钟热变性杂蛋

43、白 透析去盐透析去盐 调等电点调等电点 pH 8.0pH 8.0，硫酸铵，硫酸铵6565沉淀磷酸二脂酶沉淀磷酸二脂酶 丙酮的分级分离，丙酮的分级分离，2828沉淀杂蛋白，沉淀杂蛋白，4343沉淀酶沉淀酶取样取样 500500克克组织捣碎组织捣碎 离心去杂蛋白离心去杂蛋白 pH 5.1pH 5.1，共沉淀，共沉淀， 冷丙酮脱水，丙酮粉粗品冷丙酮脱水，丙酮粉粗品第一次硫酸铵第一次硫酸铵3333分级，分级，pH pH 6.06.0，沉淀杂蛋白，沉淀杂蛋白pH 4.9pH 4.9，硫酸铵，硫酸铵4545分级，分级，沉淀杂蛋白沉淀杂蛋白 pH 6.0pH 6.02022-5-29海南大学农学院wss60

44、细菌染色体细菌染色体DNADNA的的制备制备-1-1 加加10 mg10 mg溶菌酶，溶菌酶，37 37 保温保温10 min10 min2 23 g3 g对数期细菌湿细胞对数期细菌湿细胞用冷的用冷的50 ml 0.15 mol/L NaCl50 ml 0.15 mol/L NaCl 0.1 mol/L 0.1 mol/L EDTAEDTA（pH 8.0pH 8.0）洗涤）洗涤1 1次，悬于次，悬于30 ml30 ml同一溶液同一溶液中中2022-5-29海南大学农学院wss61加终浓度为加终浓度为2 2 SDSSDS，6060保温保温10min(10min(菌液透明菌液透明) )，待冷却后，待冷却后，加入等体积酚加入等体积酚- -氯仿氯仿- -异戊醇异戊醇(24 : (24 : 24 : 1)24 : 1)，置分液漏斗或