色谱分析第五章(1)

1、 液相色谱仪器液相色谱仪器 液相色谱柱固定相液相色谱柱固定相(分类及选择分类及选择) 液相色谱分离原理液相色谱分离原理（液固色谱法、液固色谱法、液液色谱和键合相色谱、离子交换液液色谱和键合相色谱、离子交换色谱法色谱法）第五章第五章 液相色谱法（液相色谱法（1 1）一一 色谱系统色谱系统12346578910 1. 进样装置进样装置(2)无限直径柱无限直径柱流动相+样品筛板(1)有限柱，可以出现肩峰一一 色谱系统色谱系统 2 梯度淋洗装置梯度淋洗装置溶剂A 混合室高压泵1高压泵2 程 序控制器色谱柱计量泵 (低压)溶剂A溶剂B混合室高压泵色谱柱一一 色谱系统色谱系统一一 色谱系统色谱系统 3.

2、检测器和记录仪器检测器和记录仪器 紫外吸收检测器紫外吸收检测器 二极管阵列式检测器二极管阵列式检测器 示差折光检测器示差折光检测器 荧光检测器荧光检测器 二二 色谱填充柱色谱填充柱（1）液相色谱速率理论方程的特点）液相色谱速率理论方程的特点（2）评价高效液相色谱柱参数的表达）评价高效液相色谱柱参数的表达（3）液相色谱固定相）液相色谱固定相 二二 色谱填充柱色谱填充柱1. 1. 柱阻参数和柱渗透性柱阻参数和柱渗透性 柱阻参数被定义为柱阻参数被定义为, 由下式计算由下式计算.3210LudPP23210PmPdLtdLuP渗透性由以下经验公式定义渗透性由以下经验公式定义PLuKF 二二 色谱填充柱

3、色谱填充柱2. 2. 柱效考察柱效考察 分配比 k( tR tm)/ tm 理论板数 n 16( tR / tw )2 理论板高 H L /n 折合板高 h L / dP 折合流速 v(L dP) /(Dmtm) 柱阻参数 (P tm dP2) /( L2 ) 对称因子 SI 二二 色谱填充柱色谱填充柱3. 3. 正相色谱和反相色谱法正相色谱和反相色谱法 正相色谱正相色谱: 流动相是非极性流动相是非极性, 固定相是极性的固定相是极性的 流动相的极性流动相的极性 固定相的极性固定相的极性（气相色谱法：流动相是惰性气体或双原子气体是非极性的，固定相的极性相对于流动相肯定是极性的） 反相色谱反相色谱

4、: 流动相是极性流动相是极性, 固定相是非极性的固定相是非极性的 流动相的极性流动相的极性 固定相的极性固定相的极性 三三 液相色谱分离原理液相色谱分离原理 液固色谱分离原理与色谱固定相液固色谱分离原理与色谱固定相 1. 液固色谱原理和分离对象液固色谱原理和分离对象 XmnSa = XanSm ) 316 (amnaSXSXK分配比分配比kk与溶质的吸附系数与溶质的吸附系数K的关系为的关系为: : k=K(Ws /Wm)液固色谱适用于分离中等分子量液固色谱适用于分离中等分子量( 小于小于1000 )低挥发性化合物低挥发性化合物, 分分子是非极性或中等极性的子是非极性或中等极性的, 非离子型的油

5、溶性样品非离子型的油溶性样品. 只要它们具有只要它们具有不同的官能团或者官能团的数目不同不同的官能团或者官能团的数目不同, 都适用于液固色谱分离分析都适用于液固色谱分离分析. 特别适用于分离分析异构体特别适用于分离分析异构体( 包括结构异构和空间异构包括结构异构和空间异构 ). 液固色谱固定相的吸附剂有极性和两类液固色谱固定相的吸附剂有极性和两类. .非极性吸附剂主要是活性碳非极性吸附剂主要是活性碳, ,因机械性能差因机械性能差, ,已很少使用已很少使用. .极性吸附剂有硅胶、聚酰胺、氧化铝、氧化镁和分子筛极性吸附剂有硅胶、聚酰胺、氧化铝、氧化镁和分子筛, , 常用的是硅胶和氧化铝常用的是硅胶

6、和氧化铝, , 特别是硅胶用得最多特别是硅胶用得最多 硅胶的硅羟基结构硅胶的硅羟基结构SiOHHOSiSiOHHOSiSiOSiSiOHHOSiSiOHSiOHSi OSi 液液色谱和键合色谱液液色谱和键合色谱 化学键合固定相是通过化学反应将固定液键合化学键合固定相是通过化学反应将固定液键合到载体表面到载体表面. .用化学键合固定相的液相色谱法称用化学键合固定相的液相色谱法称为化学键合相色谱为化学键合相色谱. . 适用于分离分子量不太大适用于分离分子量不太大( (最大最大3000)3000)的同系物的同系物, ,苯并系物和齐聚物等苯并系物和齐聚物等 正相键合相色谱用极性键合相正相键合相色谱用极

7、性键合相, ,非极性流动相非极性流动相. . 色谱分离类似于液固色谱色谱分离类似于液固色谱. . 反相键合相色谱用非极性键合相反相键合相色谱用非极性键合相( (例如例如, C8, C8或或C18C18键合相等键合相等 ), ), 极性流动相极性流动相. .化学键合相的合成化学键合相的合成 酯化反应和酰卤氨解反应酯化反应和酰卤氨解反应 SiOH HOR SiOR SiOH SOCl2 SiCl NH2R Si-NHR2 硅胶与有机卤硅烷反应或格氏试剂或有机锂硅胶与有机卤硅烷反应或格氏试剂或有机锂化物反应化物反应 SiOH Cl-Si-R2(或或R-Si-R2) Si-O-Si-R2 正相键合固定

8、相正相键合固定相 弱极性弱极性 正相弱极性键合固定相的官能团有二醇、醚基、正相弱极性键合固定相的官能团有二醇、醚基、三烷胺和硝基等三烷胺和硝基等, , 结构为结构为: : OH OH 二醇: (CH2)3 OCH2CHCH2) 醚基: (CH2)3 OCH2CHCH2 三烷胺: (CH2)3 N(CH3)2 中等极性中等极性键合的官能团有氰基等键合的官能团有氰基等, , 相也可以用于反相色谱相也可以用于反相色谱操作操作. . 其结构为其结构为: 氰基氰基: (CH2)n CN n=2或或3 强极性强极性键合的官能团有烷氨基、氨基和二氨基等键合的官能团有烷氨基、氨基和二氨基等, , 其结其结构为

9、构为: 氨基氨基: (CH2)n NH2 n=3或或4 二氨基二氨基: (CH2 )3 NH(CH2) 2NH2 反相键合固定相反相键合固定相 反相键合固定相所键合的烷基可以是长碳链反相键合固定相所键合的烷基可以是长碳链, , 也可以也可以是短碳链是短碳链. . 有甲基硅烷、己基硅烷、辛基硅烷、十六有甲基硅烷、己基硅烷、辛基硅烷、十六硅烷、十八硅烷、二十二硅烷等硅烷、十八硅烷、二十二硅烷等. . 其中以十八硅烷其中以十八硅烷 ( (简称简称ODS或或C18) 和辛硅烷和辛硅烷(C8)、丁基丁基（C4）等）等 影响键合固定相在色谱分离过程的行为影响键合固定相在色谱分离过程的行为硅胶表面表面覆盖度

10、、表面键合相浓度硅胶表面表面覆盖度、表面键合相浓度键合基团的链长（键合基团的链长（链越长极性越弱链越长极性越弱）载体的性质以及温度等因素载体的性质以及温度等因素在选择固定相时，除了按照键合相性质选择之外还要考在选择固定相时，除了按照键合相性质选择之外还要考虑被分离组分分子的大小选取恰当孔径大小的固定相虑被分离组分分子的大小选取恰当孔径大小的固定相载体。载体。反相键合色谱操作反相键合色谱操作 （弱）极性组分的分离（弱）极性组分的分离: :选用的流动相应与被分离组分有比较接近结构选用的流动相应与被分离组分有比较接近结构（在样品浓度下可以互溶）（在样品浓度下可以互溶）, ,并使使k k 有适当的值有

11、适当的值. . 操作温度操作温度 pH pH值的控制与离子抑制技术值的控制与离子抑制技术 以硅胶为载体的化学键合相填料, 合适的pH使用范围是27.5. 在过低或过高的pH值下使用将导致键合相的脱落或硅胶基体溶解.流动相中有机溶剂的比例流动相中有机溶剂的比例 由于以硅胶为载体的化学键合相填料有疏水性由于以硅胶为载体的化学键合相填料有疏水性, , 表面张力大表面张力大的水不易渗入到固定相的空隙之中的水不易渗入到固定相的空隙之中, , 而且而且, , 组分在疏水性表面组分在疏水性表面与水溶液之间的传质和平衡过程慢柱效降低与水溶液之间的传质和平衡过程慢柱效降低, , 从而造成色谱带从而造成色谱带展宽

12、展宽. . 为减小这种效应为减小这种效应, , 一般流动相中有机溶剂的比例不宜过一般流动相中有机溶剂的比例不宜过小小, , 以保证柱效和峰形以保证柱效和峰形. .流动相的离子强度流动相的离子强度 必要时可以在流动相中加入盐类物质必要时可以在流动相中加入盐类物质, , 溶液离子强度增加溶液离子强度增加, , 减轻了组分分子通过离子交换的途径与残留硅醇基的相互作用减轻了组分分子通过离子交换的途径与残留硅醇基的相互作用, , 减少拖尾减少拖尾. . 对复盖量小的键合相更为有效对复盖量小的键合相更为有效 . .所用的盐类可以是所用的盐类可以是无机盐无机盐( (例如例如, ,碳酸铵等碳酸铵等), ),

13、也可以是有机胺也可以是有机胺( (四烷基铵盐四烷基铵盐, ,如四如四甲基硝酸铵等甲基硝酸铵等) )或各种有机阴离子或各种有机阴离子. . 加入的盐的浓度约为千分加入的盐的浓度约为千分之几之几.水的纯度水的纯度 水中的杂质和微生物会在柱头积聚浓集水中的杂质和微生物会在柱头积聚浓集, , 使柱效降低使柱效降低, , 当流当流动相合适时动相合适时, , 还有可能被淋洗出来从而影响组分的分离和检还有可能被淋洗出来从而影响组分的分离和检测测.表 6.4 正相色谱和反相色谱的比较正相色谱反相色谱固定相硅胶、氧化铝吸附色谱固定相极性固定液分配固定相极性键合相色谱,如氰基、醚基键合相固定相非极性烷基键合相(包

14、括不同链长)、苯基键合相固定相弱极性键合相色谱,如氰基、醚基键合相固定相固定相较为稳定,保持良好柱效流动相极性比固定相弱极性比固定相强(如, 醇-水或腈水体系等);流动相粘度大, 在相同的流动相流速下,柱压降大; 但流动相磨擦热效应与正相色谱相同保留值随组分分子的极性增加而增大随流动相的极性增加而减小随组分分子的极性减小而增大随流动相的极性增强而增大分离对象可分离某些不同类型的化合物(即官能团有差别的化合物),同系物各种异构体(结构异构、顺反异构和非对映异构体)可分离某些不同类型的化合物(即官能团有差别的化合物),同系物各种异构体(结构异构、顺反异构和非对映异构体正相色谱反相色谱分离特点和特殊

15、技术适于分离油溶性非极性或极性较弱的化合物特别适用于分离极性或极性较强的化合物;离子抑制技术和离子对色谱分离离子化合物和可离子化的化合物非水反相色谱:分离极度非极性化合物;色谱柱达到平衡较快 (非极性表面的作用力弱)可以直接注射水溶液样品选择适当的流动相分离强极性化合物,出峰快, 减少拖尾;操作温度室温最高 5080, 以降低流动相粘度操作费用取决于有机溶剂品种的搭配和消耗加水可以改变流动的性质;经梯度淋洗后更容易再生;一一 色谱系统色谱系统 二二 色谱填充柱色谱填充柱第五章第五章 液相色谱法（液相色谱法（1 1）正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱 三三 液相色谱分离原理液相色谱分离原理 液

16、固色谱分离原理与色谱固定相液固色谱分离原理与色谱固定相 液液色谱和键合色谱液液色谱和键合色谱化学键合相的合成化学键合相的合成正相键合固定相正相键合固定相反相键合固定相反相键合固定相反相键合色谱操作反相键合色谱操作分离对象：（弱）极性组分的分离分离对象：（弱）极性组分的分离操作条件：温度、操作条件：温度、 pH值值 流动相组成及离子强度流动相组成及离子强度 水纯度水纯度 离子交换色谱离子交换色谱1. 1. 原理和分离对象原理和分离对象 阴离子交换阴离子交换 R+YX R+XY 阳离子交换阳离子交换 RY+X+ RX+Y+) 436 ( R RXYYXKI)446 (YYRKXXRKkI离子交换色

17、谱分配比离子交换色谱分配比 k k 与流动相中的反离子的浓度与流动相中的反离子的浓度成反比成反比: : k1/Y+流动相的pH值对离子交换色谱的分配比k也有影响。 离子交换色谱首先是用于离子化合物的分离离子交换色谱首先是用于离子化合物的分离( (如盐类如盐类),),但现在更多的是用于有机碱但现在更多的是用于有机碱(B)(B)和有和有机酸机酸(HA)(HA)的分离的分离. . 这是利用有机酸这是利用有机酸( (碱碱) )存在以存在以下平衡下平衡, , 因而可以用离子交换色谱来分离因而可以用离子交换色谱来分离: : HA H+ A BH+ HB+ 糖类在水溶液中不会以离子方式存在糖类在水溶液中不会

18、以离子方式存在. . 通过下通过下面反应面反应, , 形成硼酸盐的配合物形成硼酸盐的配合物, , 也可以用离子也可以用离子交换色谱来分离交换色谱来分离: 糖糖BO3 2 - 糖糖BO3 2 -2. 固定相, 离子交换剂 （1）离子交换剂(强酸型包括：磷酸纤维素(P)、甲基磺酸纤维素(SM)、乙基磺酸纤维素(SE)弱酸型包括：羧甲基纤维素(CM)等 ) （2）离子交换剂(强碱型包括：三乙基氨基乙基纤维素(TEAE)、弱碱型包括：二乙基氨基乙基纤维素(DEAE)、氨基乙基纤维素(AE)3. 流动相的影响流动相的影响pH值的影响 弱酸和弱碱组分在流动相中的分布系数取决于流动相pH值例如样品组分是碱例

19、如样品组分是碱.pH.pH值一定值一定, ,流动相中有以下平衡流动相中有以下平衡: : B H+ HB+ HB+ 与交换剂之间又存在以下平衡与交换剂之间又存在以下平衡: : HB+ R Y+ RHB+ Y+ 离子强度的影响离子强度的影响 流动相的离子强度增大流动相的离子强度增大, , 组分的保留值减小组分的保留值减小. 一般一般kk随离子强度的倒数成正比随离子强度的倒数成正比 增加缓冲溶液总浓度或在流动相中加入某种盐, 流动相中阴阳离子的总数增加, 它们与组分分子对交换基( R或R+ )的竞争能力增强, 即组分分子的竞争能力减弱, 使组分的k减小, 保留值减小。平衡离子的影响平衡离子的影响 离子交换溶剂强度离子交换溶剂强度, , 直接与流动相中平衡离子的种类直接与流动相中平衡离子的种类有关有关. . 各种离子与离子交换树脂上的基体离子的亲和各种离子与离子交换树脂上的基体离子的亲和力不同力不同, , 与组分分子对基体离子竞争的能力也不同与组分分子对基体离子竞争的能力也不同, , 因而影响组分的保留值因而影响组分的保留值.流动相流速的影响流动相流速的影响 由于离子交换树脂上的传质速率很慢，与其他色谱法由于离子交换树脂上的传质速率很慢，与其他色谱法不同不同,离子交换色谱柱效对流速十分敏感。随着流速增离子交换色谱柱效对流速十分敏感。随着流速增加柱效迅速下降。所以在一般操作条件下，难