COPD大鼠模型海马区和血清中BDNF蛋白的表达变化

1、中国科技论文在线COPD大鼠模型海马区和血清中BDNF蛋白的表达变化 汪群1，林勇2作者简介：汪群（1986-），女，在读硕士，COPD. E-mail: qun8612081.51.5Medical College Southeast University,Nanjing 210009;Zhong Da Hospital,Nanjing 210009东南大学医学院，南京 210009;东南大学附属中大医院，南京 21000921000913915997110;南京市东南大学丁家桥校区;南京市中大医院呼吸科qun861208;linyong63汪群（1986-），女，

2、在读硕士，COPD;林勇（1963-），男，教授汪群;林勇Wang Qun;Lin Yong汪群1.51.51.51.51.51.51.51.51*|*期刊*|*Ng TP, Niti M, Fones C,et al. Co-morbid association of depression and COPD: a population-based Study J. Respir Med, 2009 , 103(6): 895-901.2*|*期刊*|*Dodd JW,Getov SV,Jones PW. Cognitive function in COPDJ . Eur Respir J,

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18、l ModelsJ . Neuropsychopharmacology, 2010 , 35(12): 2378-2391.*|1|汪群|Wang Qun|东南大学医学院，南京 210009|Medical College Southeast University,Nanjing 210009|汪群（1986-），女，在读硕士，COPD|南京市东南大学丁家桥校区|210009|qun86120813915997110|2|林勇|Lin Yong|东南大学附属中大医院，南京 210009|Zhong Da Hospital,Nanjing 210009|林勇（1963-

19、），男，教授|南京市中大医院呼吸科|linyong63|COPD大鼠模型海马区和血清中BDNF蛋白的表达变化|The Expression of BDNF in Hippcocampus and Serum of COPD Model Rats|- 7 -（1. 东南大学医学院，南京 210009；2. 东南大学附属中大医院，南京 210009）摘要：目的 探讨BDNF在COPD大鼠模型海马区和血清中的表达情况，以及了解被动吸烟和气管内注入脂多糖的干预是否参与此过程。方法 采用被动吸烟和气管中注入脂多糖建立大鼠COPD模型。将24只大鼠随机分为4组，每组各6只，分别为正常对照组，吸烟组，脂多糖

20、组以及吸烟+脂多糖组（即COPD组）。造模28天后，应用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法测定各组大鼠血清中BDNF的表达水平，再通过免疫组化染色和图像分析方法半定量检测大鼠海马区BDNF的表达情况。结果 COPD组、吸烟组和脂多糖组血清及海马区BDNF表达水平均较正常组明显升高（p0.05），且COPD组血清及海马区BDNF表达水平均较吸烟组和脂多糖组明显降低（p0.05）。结论 COPD大鼠海马区及血清中BDNF蛋白表达水平升高，且被动吸烟和气管内注入脂多糖均可诱导BDNF蛋白表达水平升高。关键词：COPD；BDNF；吸烟；脂多糖；认知功能中图分类号：R563The Expression

21、of BDNF in Hippcocampus and Serum of COPD Model RatsWang Qun1, Lin Yong2(1. Medical College Southeast University,Nanjing 210009;2. Zhong Da Hospital,Nanjing 210009)Abstract: AIM: In clinical,we have found that cognitive impairment frequently occurs in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) pat

22、ients,but little is known about its pathophysiology. And researchers confirmed that Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) may be involved in the pathophysiology of cognitive impairment and is affected by many factors, for example,smoking，infection,hypoperfusion, hypoxia, et al. In this study, we

23、aimed to explore the expression of BDNF resulting from passive smoking and intratracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS) alone or in combination,on hippcocampal and serum . METHODS : In consideration of smoking and infection which are two main inducement of COPD, we established the rat COPD

24、 model by passive smoking and intratracheal instillation of LPS. Four rat groups were studied,with the same age and gender ratios in each group: control group (n=6), smoking group (n=6),LPS group (n=6) and smoking+LPS group (n=6,COPD model). Level of BDNF in serum was measured by ELISA.And the expre

25、ssion of BDNF in hippcocampal was assessed using immunohistochemistry and image analysis method. RESULTS :We found that compared to control group ,BDNF in hippcocampal and serum significantly increased after exposure to smoking, LPS and smoking + LPS. However,BDNF increased less in smoking + LPS mod

26、el than in smoking or LPS model both in hippcocampal and serum. CONCLUSIONS: BDNF in hippcocampal and serum of COPD group highly increased. Smoking and intratracheal instillation of LPS exposure induces the increasing of BDNF level in hippcocampal and serum.Key words: COPD, BDNF, smoking, LPS, cogni

27、tive function0 引言慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease ，COPD）发生肺部病变同时常伴有多种肺外效应，如：心功能不全、中枢神经系统功能改变等，这些肺外效应严重影响患者的生活质量、生存率及疾病的预后1。其中，中枢神经系统损害近年来研究较多，主要表现在学习记忆、文字处理、言语表达能力及精神活动等方面的改变2-4，但其具体机制目前仍不清楚。已经发现，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor ，BDNF）在神经元的分化、增殖及存活方面发挥着重要作用，当机体受到不利因素（如感染、缺氧等

28、）刺激时，其表达水平会发生相应的变化5-7。但COPD发病过程中BDNF含量是否存在变化的研究尚未见报道。鉴于吸烟和感染是引起COPD的两大主要的诱因，故本实验采用宋一平教授的吸烟+脂多糖方法建立COPD模型8，观察COPD模型大鼠海马区和血清中BDNF的表达情况。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 主要试剂 熏烟箱（自制的有机玻璃密闭箱，约30cm45cm54cm）；大前门香烟（焦油量12mg,上海卷烟厂）；脂多糖（1g/ml，美国Sigma公司）；BDNF ELISA试剂盒（由美国GBD公司提供）；BDNF一抗（购自北京博奥森有限公司）；二抗（由美国GBD公司提供）。1.1.2 大鼠资料

29、 清洁级SD大鼠24只，雌雄各半，体重200-260g（由上海斯克莱实验动物有限公司提供，许可证号为：SCXX（泸）2008-0016），鼠龄12周，本实验已通过伦理委员会批准。1.2 方法1.2.1 分组 大鼠于东南大学清洁级动物房适应性饲养一周后，随机分为正常组、吸烟组、脂多糖组及COPD组，每组6只，雌雄各半；采用宋一平8等人的吸烟+气管内注入脂多糖方法建立COPD模型。建模周期为28d，第1d和第14d：正常组和吸烟组气管内注入0.2ml的生理盐水，而脂多糖组和COPD组气管内注入0.2ml的1g/ml脂多糖水溶液；第2-13d、15-28d：正常组和脂多糖组正常饲养，而吸烟组和COP

30、D组每天上午均置入自制密闭的烟熏箱熏烟半小时（烟雾体积分数为5%），其余饲养条件相同，室温波动于25，湿度波动于55%，自由饮水和进食。1.2.2 大鼠呼吸力学指标测定 大鼠麻醉后，行气管、食管插管，再应用RM6240系列多道生理信号采集处理分析系统，测定大鼠的气道粘性阻力及动态肺顺应性。1.2.3 标本制备 造模第29d，于大鼠股动脉处采集完血标本（约3ml）后，处死大鼠，于冰块上迅速分离出大鼠脑组织和肺组织（未进行脑灌注），并将脑组织立即放入4%的多聚甲醛中固定，肺组织立即放入10%中性福尔马林中固定。1.2.4 血清中BDNF检测造模成功后，将已采集的各组大鼠血标本在常温下静置2小时后，

31、离心（3000转，15分钟），收集上清液，应用酶联免疫吸附法测定血清中BDNF的表达水平，严格按照BDNF ELISA试剂盒内的说明书进行操作。1.2.5 肺组织苏木精-伊红（HE）染色 将已固定24小时以上的肺组织脱水制备石蜡包埋，切片（厚约5mm），光镜下观察其病理形态学改变。1.2.6 脑组织BDNF蛋白免疫组化检测及图像分析脑组织经4%多聚甲醛固定24小时后，常规石蜡包埋，并进行免疫组化染色等一系列步骤后，采用Image Pro Plus 5.0彩色病理图像系统进行分析，每张切片任选5个海马区视野拍摄，测定每个视野的累积光密度值、计数阳性细胞数并计算平均光密度值。1.3 统计学处理使用

32、SPSS13.0统计软件进行，数据以均数标准差(xs)表示，进行单因素方差分析，用SNK法进行多组比较。2 结果2.1 各组大鼠呼吸力学指标结果显示COPD组气道阻力与正常组比较明显增加（p0.05），其动态肺顺应性明显下降（p0.05），提示气道气流受限。而吸烟组与脂多糖组与正常组之间无明显差别。2.2 各组大鼠肺组织HE染色结果观察在光镜观察各组大鼠肺组织，发现COPD组支气管粘膜上皮坏死、脱落，有炎症细胞浸润，以中性粒细胞和巨噬细胞为主（图1）；肺泡大小不等，肺泡壁变薄、断裂，部分融合形成肺大泡。正常组支气管粘膜正常，肺泡大小均匀（图2）。 图1 正常组 肺组织 HE200 图2 COP

33、D组 肺组织 HE200 Fig 1 HE staining of lung tissue in control group 200Fig 2 HE staining of lung tissue in COPD group 2002.3 各组大鼠血清中BDNF表达水平与正常组相比，吸烟组、脂多糖组及COPD组大鼠血清中BDNF的含量均升高（p0.05），而COPD组血清及海马区BDNF含量均较吸烟组、脂多糖组下降（p0.05），见表1。表1 各组大鼠呼吸力学指标及血清、海马区BDNF表达情况(xs)Table 1 Respiratory mechanics and BDNF expressi

34、on in hippocampus and serum in rats of each group(xs)groupNairway resistance（cmH20S/ml）dynamic lung compliance (ml/cmH20)BDNF in Serum (ng/L)BDNF in Hippcocampal（IOD）control61.060.260.390.08106.128.261 120.5469.02smoking61.260.280.400.10292.4210.40#1 286.3831.43#LPS61.590.180.420.13280.315.69#1 317.

35、8456.11#COPD63.170.86*0.270.04*262.324.56#1 219.9525.12#注：*表示与吸烟组、脂多糖组比较p0.05，#表示与正常组比较p0.05，表示与吸烟组及脂多糖组相比较p0.05。Note : *p0.05 vs smoking group or LPS group;# p0.05 vs control group; p0.05 vs smoking group or LPS group.2.4 各组大鼠海马区BDNF表达水平免疫组化结果显示，BDNF蛋白主要表达于神经胶质细胞、神经元等细胞的胞浆及胞膜中（见图3-4）。通过Image Pro Pl

36、us 5.0彩色病理图像系统进行分析，得出各组的阳性细胞平均光密度（见表1）。结果显示，与正常组相比，COPD组、吸烟组、脂多糖组BDNF含量均升高（p0.05），且COPD组血清及海马区BDNF含量均较吸烟组和脂多糖组降低（p0.05）。 图3 正常组 脑组织 免疫组化染色400 图4 COPD组 脑组织 免疫组化染色400Fig 3 Immunohistochemical staining of brain tissue in control group 400 Fig 4 Immunohistochemical staining of brain tissue in COPD group

37、 4003 讨论研究发现至少有20%-40%中到重度的COPD患者伴有焦虑和抑郁症状4。而作为营养因子家族一员的BDNF，主要由神经胶质细胞和神经细胞分泌，不仅在神经元功能方面起到重要作用，而且还参与调节海马区认知功能，其表达水平的变化可能会间接反映出脑功能的变化9-11。但COPD是否会引起BDNF表达水平变化，目前，国内外研究尚未报道。本实验主要目的是通过建立COPD模型，来探讨此问题，以及了解单纯的烟熏和气管内注入脂多糖是否参与BDNF表达过程。实验发现烟熏组的大鼠BDNF的表达水平明显升高，这与Xiang Yang Zhang及Cheng Ching Wang等人的研究结果相类似，提示

38、吸烟可能发挥保护认知功能的作用12-13；这可能与烟草中的尼古丁通过胆碱能系统来调解BDNF表达有关14-16。然而，也有些报道与之相反，他们发现吸烟并不能预防和缓解认知功能障碍17,18。至于具体原因，目前尚未明确。另外炎症反应在COPD发病过程中也起到重要作用，本实验脂多糖组的大鼠血清和海马区BDNF浓度均较正常对照组明显升高，这可能与早期机体在炎症因子刺激下发挥代偿性的保护作用有关。脂多糖注入机体后，早期（24h内）会激活下丘脑-垂体-肾上腺轴来抑制BDNF的表达19-20，故早期可发现BDNF一过性的表达下降；之后，脂多糖可与胶质细胞上的TLR3受体结合，活化胶质细胞，后者通过分泌BD

39、NF等物质发挥保护性作用；长期或/和大剂量刺激，由于炎症因子的作用，胶质细胞变得高度易损伤和凋亡，受损伤的胶质细胞一方面保护性物质（如：BDNF）分泌减少，一方面它可能通过释放自由基等导致神经细胞发生病变和凋亡21-25。而本实验发现COPD组大鼠血清及海马区BDNF表达水平高于对照组，但低于吸烟组和脂多糖组，这可能与烟草中的尼古丁抑制脂多糖诱导胶质细胞的活化与增殖反应26。另外，COPD组的呼吸力学指标中的粘性阻力较正常组、吸烟组和脂多糖组均增加且动态肺顺应性下降，故呼吸受限所致的低氧可能也影响BDNF表达情况。COPD组BDNF表达较正常组高，可能是由于早期机体处于一个代偿阶段，若这些诱因

40、继续存在，到后期可能会下降并同时伴有相应症状出现。在对抑郁症、阿兹海默病等患者的研究中也发现了类似的情况这些患者的血清及脑中的BDNF水平在疾病的早期升高，后期便下降，且BDNF的浓度与其症状之间存在正相关关系，通过抗忧郁治疗后BDNF的表达水平会升高，若予以外源性BDNF亦会产生抗忧郁样作用27-29。4 结论本实验发现，COPD组大鼠血清及海马区BDNF蛋白的表达水平较正常组明显升高，这可能属于COPD早期的一种代偿性的保护反应，但是炎症因子、呼吸受限及烟草中的尼古丁等也可能参与BDNF的表达过程。本实验结果提示，通过检测血清中BDNF的浓度，可能会对早期预防和治疗COPD患者的神经功能损

41、害起到一定的作用。但有关COPD患者认知与BDNF表达水平之间关系还需进一步研究。参考文献 (References)1 Ng TP, Niti M, Fones C,et al. Co-morbid association of depression and COPD: a population-based Study J. Respir Med, 2009 , 103(6): 895-901.2 Dodd JW,Getov SV,Jones PW. Cognitive function in COPDJ . Eur Respir J, 2010 , 35(4): 913-922.3 Anto

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44、fect of chronic hypoxia on the neurochemical profile of the developing rat hippocampusJ. Brain Res Dev Brain Res, 2005, 156(2): 202-209.7 Nagahara AH, Merrill DA, Coppola G, et al. Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor in rodent and primate models of Alzheimers diseaseJ. Nat M

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48、schizophreniaJ. Psychopharmacology, 2010, 212(3):301- 307.13 Wang CC, Lu TH, Liao WC, et al. Cigarette smoking and cognitive impairment: A 10-year cohort study in TaiwanJ. Archives of Gerontology and Geriatrics, 2010, 51(2):143-148.14 Correll JA, Noel DM,Shenppard AB, et al.Nicotine sensitization an

49、d analysis of brain-derived neurotrophic factor in adolescent beta arrestin-2 knock-out miceJ. Synapse, 2009, 63(6): 510-519.15 Gallowitsch M, Tracey KJ. Immunologic role of the cholinergic anti-inflammatory pathway and the nicotinic acetylcholine alpha 7 receptorJ.Ann N Y Acad Sci, 2005, 1062:209-219.16 Swan GE, Lessov-Schlaggar CN. The effects of tobacco smoke and nicotine on cognition and the brainJ. Neuropsychol. Rev, 2007, 17(3):259-273.17 Tyas SL, White LR, Petrovitch H, et al. Mid-life smoking and late-life dementia: the Honolulu-Asia aging studyJ. Neurobiol Aging , 2003,