液相故障排除

1、探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州故障排除故障排除探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州 发现问题发现问题 定位问题定位问题 纠正问题纠正问题 防止问题的再发生防止问题的再发生 主要规则主要规则探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州故障特征故障特征1. 色谱峰展宽2. 压力升高螺丝、金属箍、毛细管螺丝、金属箍、毛细管相应的对策相应的对策1. 用配套的螺丝、金属箍和毛细管2. 连接进样器和色谱柱之间的管道 (柱外死体积)应尽可

2、能地短螺丝、金属箍和毛细管故障螺丝、金属箍和毛细管故障探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州死体积死体积连接螺丝包括一个螺母和一个套在毛细管上的金属箍；它们必须和完全匹配当完全匹配时，毛细管的顶端将和仪器或柱子的端口恰好吻合，而不至于形成死体积死体积会导致出现肩峰和双重峰注意：注意：不同生产厂家的螺丝和金属不同生产厂家的螺丝和金属箍是不能通用的。箍是不能通用的。螺丝、金属箍、毛细管螺丝、金属箍、毛细管探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州毛细管毛细管1. 从泵到检测器所有毛细连接中，

3、毛细管的内径应逐渐减小。(如泵-进样器连接用内径为0.5 mm的毛细管；进样器-柱子以及柱子-检测器连接用0.2 mm的毛细管)3. 大内径的毛细管导致宽峰4. 太长的管子导致峰的分辨率差，特别是换用微径柱时2. 在使用微径柱(3 mm或2 mm)或梯度解吸时，选择合适内径和合适长度的毛细管尤为重要注意：注意：使用短的和内径小的毛细管可以将和毛细管有关的柱外体积使用短的和内径小的毛细管可以将和毛细管有关的柱外体积 效应降到最低效应降到最低螺丝、金属箍、毛细管螺丝、金属箍、毛细管探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州流动相的准备流动相的准备

4、1. 使用色谱纯的溶剂和优级纯的试剂2. 用S&S公司的0.45 m 的滤膜将所用的溶剂和缓冲溶液过滤3. 使用HPLC级(或梯度级)的溶剂(如MERCK的溶剂事先都经过过滤)4. 使用醋酸盐缓冲溶液比使用磷酸盐缓冲溶液要好，但应注意醋酸盐缓 冲液在近紫外区的吸收5. 使用酸或碱准备缓冲溶液要比使用盐好6. 使用0.04%的叠氮钠溶液以防止流动相长菌 溶剂溶剂探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州流动相脱气流动相脱气使用不脱气或脱气不完全的流动相会导致形成气泡、泵性能不稳定、检测器噪音高以及其它检测器故障020406080100120He

5、atingHeliumVacuumUltrasonic 注意：注意： 1. 加热是流动相脱气的最好方加热是流动相脱气的最好方 法，但不方便法，但不方便2. 氦气脱气也很方便，仅需几氦气脱气也很方便，仅需几 分钟就可以完成分钟就可以完成 3. 真空过滤脱气效果较差，但真空过滤脱气效果较差，但 很方便，也很经济，不失为很方便，也很经济，不失为 一常规办法一常规办法溶剂溶剂探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州溶剂纯度的影响溶剂纯度的影响溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰”，特别是梯度解吸时注意：注意： 只能使用色谱级的溶剂只能使用色谱级的溶剂! 不

6、能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液溶剂溶剂探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州溶剂混合产生的问题溶剂混合产生的问题流动相中所使用的不同溶剂必须互溶注意：注意：过高浓度的磷酸盐缓冲溶液可能会在有机溶剂中析出过高浓度的磷酸盐缓冲溶液可能会在有机溶剂中析出流动相中溶剂不互溶会导致:1. 基线漂移，2. 保留时间的重现性差，3. 出现肩峰和“鬼峰”的问题.溶剂溶剂探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州样品的溶解样品的溶解样品应该溶解于流动相中，如果样品在流动相中

7、的溶解性实在太差，则应将进样体积降到很低(如1 l)选用不合适的溶剂溶解样品可能会导致保留时间的重现性差，肩峰、双重峰和“鬼峰”溶剂溶剂探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州缓冲溶液和离子对系统缓冲溶液和离子对系统1. 应保持缓冲溶液的浓度在20 mM到50mM之间，以获得最佳的分析结果2. 浓度过低的缓冲溶液体系会导致峰形差，分辨率低3. 一种缓冲溶液的最有效的缓冲pH范围是偏离其pKa值 1 pH单位不同缓冲体系的缓冲范围不同缓冲体系的缓冲范围缓冲溶液种类缓冲溶液种类 pKa 缓冲范围缓冲范围磷酸盐 2.1 1.1 - 3.1 7.2

8、 6.2 - 8.212.311.3 - 13.3醋酸盐 4.8 3.8 - 5.8柠檬酸盐 3.1 2.1 - 4.1 4.7 3.7 - 5.7 5.4 4.4 - 6.4溶剂溶剂探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州故障特征故障特征“鬼峰”(由已被污染的过滤头造成)保留时间不断改变(由于过滤头堵塞或部分堵塞)清洗步骤清洗步骤：1. 水2. 稀硝酸3. 水4. 异丙醇5. 水(超声波清洗超声波清洗)流动相过滤头产生的问题流动相过滤头产生的问题溶剂溶剂探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-1

9、6 台州进样体积进样体积进样量过大会导致峰形不对称以及保留时间变短的问题通常引起色谱柱过载或超出检测器的检测限是由于样品浓度过高而不是体积的问题过大的进样体积会导致产生宽峰注意：注意： 使用微径柱时，必须保使用微径柱时，必须保 证柱子不要过载证柱子不要过载进样进样探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州Sample size effectsSample amount 1 g/g silicaok 10 g/g silicaprobably ok100 g/g silicaoverloaded; ok for preparative LC探索

10、色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州获得高重现性结果的要求获得高重现性结果的要求 各批次之间的重现性好每根柱子之间的重现性好峰形对称分离效率高，选择性好色谱柱故障的原因色谱柱故障的原因柱子的寿命 63%反压升高 23%重现性变差18%分离效率降低12%色谱柱色谱柱探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州避免问题的避免问题的“秘诀秘诀” 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2 - 8.0避免流动相组成及极性的剧烈变化流动相使用

11、前必须经脱气和过滤处理如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕将柱子冲洗干净，并保存在乙腈中压力升高是需要更换预柱的信号色谱柱色谱柱探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州非极性固定相非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8等)的再生： 水 乙腈 氯仿(或异丙醇) 乙腈 水0.05 M 稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱色谱柱的再生色谱柱的再生 直接将色谱柱连接到泵，每种清洗溶剂用20倍柱体积极性固定相极性固定相(如Si, NH2, CN, DIOL基色谱填料)的再生：正庚烷 氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 水注意：在通常情况

12、下，最好是更换色谱柱；花费太多的时间用于色谱柱再生而不能注意：在通常情况下，最好是更换色谱柱；花费太多的时间用于色谱柱再生而不能 保证正常的分析工作是得不偿失的。保证正常的分析工作是得不偿失的。色谱柱色谱柱探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州柱外死体积柱外死体积柱头的死体积会导致产生双重峰或脱尾峰而且，已被污染的预柱或柱子滤网也会导致产生类似的问题色谱柱色谱柱探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州色谱柱色谱柱(压力压力)问题问题当色谱柱连接到泵当色谱柱连接到泵 将柱子反向冲洗； 和

13、进样器时，压力和进样器时，压力 柱头滤网堵塞 更换滤网；特别高特别高 更换色谱柱 柱头填料变脏将柱子反向冲洗；取下滤网，挖去柱头变脏的填料，填入新的填料； 更换色谱柱当柱子连接到检测当柱子连接到检测器时器时,压力很高压力很高 柱子和检测器之间 停泵!(危险：检测池可能会堵塞) 的管道堵塞 更换管子可能原因可能原因 解决办法解决办法探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州压力高压力高没有出峰没有出峰;峰高改变峰高改变解决问题解决问题 可能原因可能原因 解决办法解决办法 预柱堵塞 更换预柱 柱头堵塞 更换柱头的滤网；反向冲洗柱子； 更换色谱柱

14、毛细管堵塞 更换毛细管可能原因可能原因泵没有开流速；系统有漏进样体积或浓度的重现性差解决办法解决办法检查泵；检查接头；检查流动相的组成；检查系统是否有漏检查进样系统以及样品的均匀性探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州噪音高或基线漂移噪音高或基线漂移解决问题解决问题可能原因可能原因柱子没有平衡好杂质组分从色谱柱中缓慢流出杂质在柱子中的富集检测器或色谱柱的温度差异系统有气泡检测器氘灯需更换电压不稳造成干扰解决办法解决办法继续冲洗色谱柱至平衡利用强极性的溶剂冲洗色谱柱冲洗色谱柱；改进和提高样品的预处理；使用液相色谱纯的溶剂使用色谱柱恒温箱流动

15、相脱气；使用反压调节器更换氘灯（氘灯使用寿命一般为1000小时）使用稳压电源；检查供电系统探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州出现出现“鬼峰鬼峰”解决问题解决问题可能原因可能原因上一针样品中没有完全流出的物质样品中未知的组分色谱柱被污染溶剂中有杂质流动相和溶解样品的溶剂不互溶三氟乙酸被氧化解决办法解决办法待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个样品；每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；改进样品的预处理；组分复杂的样品尽可能使用梯度解吸的方法改进样品的预处理每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；改进样品的预处理使用色谱纯的溶

16、剂尽可能用流动相溶解样品流动相尽量每天新配；使用三氟乙酸时，应使用抗氧剂探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州出现肩峰或出现肩峰或前延峰前延峰解决问题解决问题可能原因可能原因预柱被污染或选用了不合适的预柱柱头“塌陷”造成死体积或是柱子内部有短流出现溶解样品的溶剂选择错误干扰物质的存在；样品中的杂质色谱柱过载柱外效应的影响解决办法解决办法更换预柱更换色谱柱用流动相溶解样品，如果不可以，应将进样体积降至很低（如1微升）改进样品预处理；用测试的混合物检验色谱柱；使用色谱纯溶剂将样品稀释检查毛细管连接探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领

17、域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州峰形展宽峰形展宽解决问题解决问题解决办法解决办法更换色谱柱或预柱减少进样体积；稀释样品用流动相溶解样品使用浓度稍高的缓冲溶液或者换用其它的缓冲溶液检查毛细管连接检查是否有漏；使用小的检测池提高色谱柱温度使用内径较细的较短的毛细管连接；检查柱外死体积使用较小粒径填料的色谱柱；更换色谱柱可能原因可能原因色谱柱或预柱被污染或不合适色谱柱“过载”或进样体积过大溶解样品的溶剂选用不当缓冲溶液的浓度太稀柱外效应的影响色谱柱和检测器之间有漏；检测器的检测池过大色谱柱温度太低；流动相的黏度太高连接用的毛细管太长；柱外死体积太大色谱柱柱效下降探索色谱新领域，默克与

18、您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州出现脱尾峰出现脱尾峰解决问题解决问题解决办法解决办法减少样品体积；增大色谱柱内径；使用高容量的固定相改进样品预处理；调节流动相的组成；使用测试样品混合物检查色谱柱；使用色谱纯溶剂使用流动相改性剂（如三乙胺）；提高缓冲溶液或盐溶液的浓度（离子对色谱）降低流动相的pH值；使用碱性去活的色谱柱更换滤网；使用柱前过滤系统；将样品过滤检查毛细管连接更换色谱柱；使用性质较温和的分离条件可能原因可能原因色谱柱过载干扰峰；杂质硅胶表面未完全键合的硅羟基的影响色谱柱的滤网堵塞柱外效应的影响；死体积色谱柱有“塌陷”、短流或断流探索色谱新领域，

19、默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州出现双重峰或出现双重峰或分叉峰分叉峰解决问题解决问题可能原因可能原因样品体积过大；色谱柱过载溶解样品的溶剂选用不当色谱柱有“塌陷”、短流或断流色谱柱滤网堵塞进样器没有彻底清洗解决办法解决办法减少进样体积；稀释样品；将样品在流动相中溶解；如果不行，尽可能将进样体积降低（如1微升）更换色谱柱；使用较温和的分离条件更换色谱柱的滤网；使用柱前过滤装置；过滤样品彻底清洗进样器；更换进样器转子探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州保留时间变长保留时间变长解决问题解决问题可能

20、原因可能原因流速降低硅胶表面有活性点键合相流失流动相的组成有变化温度降低解决办法解决办法检查系统是否有漏；更换泵的密封圈；排净气泡；使用流动相改性剂（如加入三乙胺）；使用碱性去活的色谱柱保持流动相pH值在2-7.5 范围内检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州保留时间缩短保留时间缩短解决问题解决问题可能原因可能原因流速升高色谱柱过载键合相流失流动相组成发生变化温度升高色谱柱老化解决办法解决办法检查泵；检查流速降低样品的浓度或进样体积流动相的pH值保持在2-7.5 范围内检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱更换色谱柱；使用预柱探索色谱新领域，默克与您共同努力！探索色谱新领域，默克与您共同努力！2005-03-16 台州保留时间保留时间无规则改变无规则改变解决问题解决问题可能原因可能原因流速发生变化色谱柱尚未平衡；缓冲溶液容量不够流动相组成发生变化