动物细胞培养

1、动物细胞培养 2001年年2月，一只特别的活老鼠在北京引起轰月，一只特别的活老鼠在北京引起轰动动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。与众不同的是，这只小白鼠浑身没毛的小白鼠。与众不同的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人人耳耳”。这只老鼠背上的。这只老鼠背上的“人耳人耳”，展示的是我国，展示的是我国“863”计划的一项科研成果。这只老鼠身上的计划的一项科研成果。这只老鼠身上的“人耳人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术

2、复制出来外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。的。 背上长背上长“人耳人耳”的老鼠从上海空运至北京后，的老鼠从上海空运至北京后，住进了一家大饭店。住进了一家大饭店。“人耳鼠人耳鼠”展出时，被放到展出时，被放到一个透明的盒子里，里面没有水，没有饲料，也一个透明的盒子里，里面没有水，没有饲料，也没有过滤空气的装置，因此，每次展出时间不过没有过滤空气的装置，因此，每次展出时间不过一两个小时。长一两个小时。长“人耳人耳”的老鼠亮相京城，透露的老鼠亮相京城，透露了一条信息了一条信息随着人类生命奥秘的揭晓，有随着人类生命奥秘的揭晓，有朝一日人体就会像一辆汽车一样，哪个零件坏了，朝一日人体就会像一辆

3、汽车一样，哪个零件坏了，可再买一个新的换上。可再买一个新的换上。 1991年，曹谊林教授在美国哈佛大学医学年，曹谊林教授在美国哈佛大学医学院和麻省大学医学中心学习期间，取得在院和麻省大学医学中心学习期间，取得在国际医学界引起震撼的国际医学界引起震撼的“老鼠背上长人耳老鼠背上长人耳”这一软骨细胞移植术的新成就。曹谊林教这一软骨细胞移植术的新成就。曹谊林教授说，授说，“人耳鼠人耳鼠”的制作关键在的制作关键在“人耳人耳”，先用一种高分子化学材料聚羟基乙酸做成先用一种高分子化学材料聚羟基乙酸做成人耳的模型支架，让细胞在这个支架上繁人耳的模型支架，让细胞在这个支架上繁殖生长，然后，在裸鼠的背上割开一个口

4、殖生长，然后，在裸鼠的背上割开一个口子，将已经培养好的子，将已经培养好的“人耳人耳”植入后缝合。植入后缝合。“人耳人耳”支架最后会自己降解消失，于是，支架最后会自己降解消失，于是，“人耳人耳”便与老鼠浑然成为一体。便与老鼠浑然成为一体。为什么要进行动物细胞培养?1.1.动物细胞培养动物细胞培养如何进行细胞培养?培养时又需要提供哪些必要条件呢？2.2.12.2.1动物细胞培养动物细胞培养和核移植技术和核移植技术 从动物机体中取出相关组织，将它们分散从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。些细胞生长和增殖

5、。1.1概念概念1.2 1.2 动物细胞培养动物细胞培养过程过程 胚胎或幼龄动物的组织器官胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液细胞悬液10代细胞代细胞50代细胞代细胞剪碎胰蛋白酶洗涤、稀释、分离原代培养用用胰蛋白酶胰蛋白酶分散分散细胞，说明细胞细胞，说明细胞间的物质主要是间的物质主要是蛋白质蛋白质。动物细。动物细胞培养适宜的胞培养适宜的PH为为7.27.4，此环境下胃蛋白此环境下胃蛋白酶（酶（2.0）没有）没有活性，而胰蛋白活性，而胰蛋白酶酶(7.2-8.4)的活的活性较高。性较高。比老比老龄动龄动物的组织物的组织细胞增殖细胞增殖能力强，能力强，有丝有丝分裂分裂旺盛旺盛。分分化程度化程度越越低，低

6、，增殖增殖能力越强，能力越强，越越容易培容易培养。养。动物细胞培养动物细胞培养不能最终培养不能最终培养成生物体成生物体细胞增殖细胞增殖缓慢，核缓慢，核型可能变型可能变化化动物组织细胞间隙中含有一定动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。和韧性的组织和器官。贴壁生长接触抑制10代以内，保持正常二倍体核型代以内，保持正常二倍体核型传代培养 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：根据你所学的内环境的知识，思考以

7、下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 讨讨 论论葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子和葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子和动物血清等。动物血清等。适宜温度、适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境和气体环境；无菌无毒环境获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞或细胞产品细胞或细胞产品新的个体或细胞产品新的个体或细胞产品培养结果培养结果或细胞产物或细胞产物快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清促促生长

8、因子生长因子蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原原 理理动物细胞培动物细胞培养养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较 大规模的生产有重要价值的生物制品大规模的生产有重要价值的生物制品 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体为基因工程技术提供受体细胞为基因工程技术提供受体细胞 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植有毒物质的检测有毒物质的检测细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究

9、 如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供依据防癌症及其他疾病提供依据动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用2.2.动物细胞动物细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物 将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）动物个体（克隆动物）分分类类胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度低，恢

10、复全能性容易 细胞分化程度细胞分化程度高高，恢复全能性，恢复全能性不不容易容易2.1 动物细胞动物细胞核移植概念：核移植概念：2.2体细胞核移植的过程：体细胞核移植的过程：请看教材请看教材P48图图2-21思考：思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？ M中期卵母细胞中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。细胞分裂和发育进程。主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植

11、株用用 途途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振荡、电刺激）荡、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原原 理理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比植物、动物细胞融合的比较较讨论：讨论：1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之在体细胞的细胞核移植到受体

12、卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？ 为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。胞的遗传物质去掉或将其破坏。 培养的动物细胞一般当传代至培养的动物细胞一般当传代至1050代代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以代

13、以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代正常的遗传基础，通常采用传代10代以内代以内的细胞。的细胞。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？代以内的细胞，想一想，这是为什么？3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？绝大部分绝大部分DNA来自于供

14、体细胞核，但其核外还有少来自于供体细胞核，但其核外还有少量的量的DNA，即线粒体中的，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母是来自于受体卵母细胞。细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物

15、100%的复制。的复制。2.3体细胞核移植技术的应用前景：体细胞核移植技术的应用前景：1、在畜牧业中可以加、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种、保护濒危物种3、医药卫生领域生产、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官医用蛋白质及组织器官的移植的移植4、了解胚胎发育和衰老过程；追、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病踪研究疾病的发展过程和治疗疾病 1、成功率比较低2、大多存在健康问题3、克隆动物食品安全问题2.4体细胞核移植技术存在的问题：体细胞核移植技术存在的问题：思考与探究思考与探究2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞

16、培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（年，美国威斯康星州

17、的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为年平均水平仅为34 t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上利用

18、卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。的后代，从而加快奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。现近亲繁殖而引起种质衰退。（2）如

19、果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融

20、合，这时供体核就进入了受体卵母母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。同期发情处理的受体母牛体内。4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。研究方面研究方面：克隆动

21、物基因组重新编程的机制尚不清克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。应用上应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。有一定距离。一、动物细胞融合一、动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用动动物物细细胞胞融融合合细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒

22、新城鸡瘟病毒用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核二、单克隆抗体二、单克隆抗体什么是抗体？什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。淋巴细胞产生抗体。B淋巴细胞与抗体淋巴细胞与抗体B淋巴细胞受抗原刺激后，可以淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。产生抗体。动物体内的动物体内的B淋巴细胞可以产生淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原

23、具有特异性免疫作用。原具有特异性免疫作用。每一个淋巴细胞只能产生一种抗每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。体。单克隆抗体单克隆抗体 由单个由单个B淋巴细胞经过无性繁殖淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点：特点：特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 如何大量生产单克隆抗体？如何大量生产单克隆抗体？ 利用淋巴细胞产生抗体的功能利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技

24、术将两种细胞融利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞交瘤细胞 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体思考：思考：1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，

25、细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：应用主要有：1、临床诊断、临床诊断2、作为载体