《生物技术实践》复习课件

1、一、微生物的培养与分离一、微生物的培养与分离 微生物的培养与分离微生物的培养与分离培养基的配制培养基的配制微生物的分离微生物的分离纯化大肠杆菌的操作纯化大肠杆菌的操作 某种微生物数量的测定某种微生物数量的测定土壤中分解尿素细菌的分离与计数土壤中分解尿素细菌的分离与计数 培养基对微生物的选择作用培养基对微生物的选择作用分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离 利用微生物进行发酵来生产特定的产物利用微生物进行发酵来生产特定的产物u果酒、果醋、腐乳的制作果酒、果醋、腐乳的制作 发酵过程中亚硝酸盐含量的测定发酵过程中亚硝酸盐含量的测定u制作泡菜并检测亚硝酸盐含量制作泡菜并检测亚硝酸盐含量 微生

2、物的培养：微生物的培养：1.培养基培养基培养基的种类培养基的种类依据物理性质、化学成分、用途划分依据物理性质、化学成分、用途划分培养基的营养培养基的营养碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐配制培养基的操作：配制培养基的操作：倒平板与平板倒置倒平板与平板倒置u制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算（配方比例）计算（配方比例）称量（各种成分）称量（各种成分）溶化（琼脂）溶化（琼脂）调整调整pH灭菌灭菌倒平板倒平板2.灭菌与消毒方法及对象灭菌与消毒方法及对象灭菌方法：灭菌方法：灼烧、干热、高压蒸汽、过滤灭菌法灼烧、干热、高压蒸汽、过滤灭菌法灭菌对象：灭菌对象：培养基、培养皿

3、、接种用具等培养基、培养皿、接种用具等消毒方法：消毒方法：煮沸消毒、巴氏、酒精、过氧乙酸、紫外煮沸消毒、巴氏、酒精、过氧乙酸、紫外线线消毒的对象：消毒的对象：操作台、操作空间、操作者的衣着和双手操作台、操作空间、操作者的衣着和双手3.接种接种纯化大肠杆菌的操作纯化大肠杆菌的操作平板划线法平板划线法平板划线操作五区划线法倒置培养皿稀释涂布平板法系列稀释操作涂布平板操作：4. 培养培养恒温培养箱恒温培养箱u培养：放在培养箱中，适宜恒温、培养：放在培养箱中，适宜恒温、氧气、二氧化碳的含量氧气、二氧化碳的含量5. 观察观察菌落：菌落：u菌落群体结构特征：菌落群体结构特征：菌落的形状、大小、边缘、光泽度

4、、菌落的形状、大小、边缘、光泽度、隆起度、透明度等隆起度、透明度等u是菌种鉴定重要依据是菌种鉴定重要依据u菌落的观察二、二、某种微生物数量的测定：某种微生物数量的测定：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.选择菌种选择菌种2.梯度稀释培养菌液梯度稀释培养菌液3.稀释涂布接种稀释涂布接种4.统计菌落数目：p样品稀释度足够高时，样品稀释度足够高时，一个菌落一个菌落来源于样品来源于样品稀释液中的稀释液中的一个活菌一个活菌（不是绝对的）。（不是绝对的）。p实验至少要涂布实验至少要涂布三个平板三个平板作为重复组作为重复组p一般选择一般选择菌落数在菌落数在30300的平板计数

5、的平板计数p每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数p平均菌落数平均菌落数稀释液的体积稀释液的体积稀释的倍数稀释的倍数稀释涂布平板法稀释涂布平板法鉴别培养基鉴别培养基固体固体选择培养基选择培养基液体液体三、培养基对微生物的选择作用三、培养基对微生物的选择作用分解纤维素微生物的分离分解纤维素微生物的分离四、利用微生物进行发酵来生产特定的产物四、利用微生物进行发酵来生产特定的产物果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作果酒果醋实验原理酵母菌无氧分解葡萄糖产生酒精醋酸杆菌有氧分解葡萄糖、乙醇产生醋酸实验设计操作过程挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵醋酸发酵 无氧1-3周 有氧10天左右 生成果酒 生成果醋结果评价成分鉴定

6、3mol/LH2SO4 3滴、饱和重铬酸钾溶液3滴，酒精与重铬酸钾反应呈现灰绿色或通过嗅味和品尝观察菌膜、嗅味、品尝，检测和比较醋酸发酵前后的pH、显微镜观察。.实验原理2. 操作条件3.实验设计及操作实验设计及操作. 课题成果评价是否完成腐乳的制作腐乳质量的评价影响腐乳质量的因素：1. 实验原理：实验原理：乳酸菌无氧条件将葡萄糖分解成乳酸。泡菜中微生物将蔬菜中硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐在特定的条件下会转变成致癌物亚硝胺。用对氨基苯磺酸重氮法测量亚硝酸盐含量（紫红色）：在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸形成重氮化合物，再与N-1-萘基乙二胺偶合，形成紫红色染料与标准显色液比较、定量分析。

7、 2. 操作步骤操作步骤腌制泡菜腌制泡菜 制备标准显色液制备标准显色液 制备样品处理液制备样品处理液 比色比色结果分析计算结果分析计算u腌制条件的控制腌制条件的控制将坛口用水封好，防止外界空气进入坛中要加一些白酒（白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，是一种调味剂，可增加醇香感）腌制条件的控制：温度、食盐量、腌制时间温度过高、食盐用量不足10、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10天后，亚硝酸盐的含量开始下降。、亚硝酸盐含量的测定、亚硝酸盐含量的测定泡菜亚硝酸盐含量（泡菜亚硝酸盐含量（mg/kg）= 样品亚硝酸盐含量样品亚硝酸盐含量 取样量（取样量（40ml滤液）滤液）比

8、色亚硝酸含量单位：比色亚硝酸含量单位：1g= 10-3mg取样量：取样量：0.41/260/50040/100 = 9.610-3kgu泡菜亚硝酸盐含量的计算泡菜亚硝酸盐含量的计算p观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出与观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出与标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并标准液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并计算。每隔计算。每隔2天测一次，将结果记录下来。天测一次，将结果记录下来。 4.实验结果分析实验结果分析1号坛2号坛3号坛1月4日0.150.150.151月8日0.600.200.801月12日0.200.100.601月15日0.

9、100.050.201月19日0.100.05020u解释数据：腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些硝酸盐还原菌的繁殖，可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。第9天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降。随着腌制时间的延长，泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作，使其生长繁殖受到影响。果酒、果醋、腐乳、泡菜相关内容比较比较果酒果醋腐乳泡菜微生物酵母菌醋酸杆菌毛霉菌乳酸菌生物类型真核原核真核原核呼吸类型兼性厌氧酒精需氧醋酸需氧菌丝层厌氧乳酸生殖类型出芽生殖分裂生殖孢子生殖分裂生殖原理无氧分解葡萄糖产生酒

10、精。有 氧 分 解葡 萄 糖 、乙 醇 产 生醋酸。毛 霉 分 解 蛋白质和脂肪，配 料 腌 制 生成腐乳香气。乳 酸 菌 无氧 分 解 葡萄 糖 产 生乳酸。果酒、果醋、腐乳、泡菜相关内容比较比较比较果酒果酒果醋果醋腐乳腐乳泡菜泡菜微生物微生物生物类型生物类型呼吸类型呼吸类型生殖类型生殖类型原理原理微生物的培养与分离主要考查内容微生物的培养与分离主要考查内容培养基的类型与配制培养基的类型与配制液体、固体、选择、鉴别液体、固体、选择、鉴别倒平板、平板倒置倒平板、平板倒置灭菌与消毒灭菌与消毒灭菌与消毒的方法与对象灭菌与消毒的方法与对象接种方法接种方法平板划线法、稀释涂布平板法平板划线法、稀释涂布

11、平板法微生物的培养微生物的培养温度、温度、pH、含氧量、培养箱、天数、含氧量、培养箱、天数观察结果观察结果菌落形态、菌落周围透明圈、抑菌圈等菌落形态、菌落周围透明圈、抑菌圈等二、酶的研究与应用果胶酶在果汁生产中的作用探讨加酶洗衣粉的洗涤效果酵母细胞的固定化1.实验原理：果胶是植物细胞壁的主要成分，果胶酶果胶是植物细胞壁的主要成分，果胶酶和果胶甲酯酶可水解果胶，与制取果汁和果胶甲酯酶可水解果胶，与制取果汁有关有关果胶酶适宜温度范围：果胶酶适宜温度范围：10-50 适适宜宜pH值为值为3.2-5.0相同重量的苹果泥在不同温度或相同重量的苹果泥在不同温度或pH值下值下和相同时间内比较果汁产量，从而确

12、定和相同时间内比较果汁产量，从而确定果胶酶的最适反应温度或果胶酶的最适反应温度或 pH值值2. 实验设计实验设计操作步骤操作步骤：设置不以温度或设置不以温度或pH梯度梯度探究最适温度或探究最适温度或pH值值.观察并记录数据观察并记录数据 4.结果分析与评价结果分析与评价曲线图形式表示不同温度或不同曲线图形式表示不同温度或不同pH下，下，制作制作1L果汁与果胶酶用量的关系，果汁与果胶酶用量的关系，分解果汁的最适温度和分解果汁的最适温度和pH。如何判断果胶是否被全部分解如何判断果胶是否被全部分解 果胶不溶于酒精（混浊）果胶不溶于酒精（混浊）. 原理：原理：利用添加了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶

13、利用添加了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等酶类的洗衣粉，将蛋白质、油脂、淀粉、纤维等酶类的洗衣粉，将蛋白质、油脂、淀粉、纤维素等类污渍水解成水溶性小分子物质。素等类污渍水解成水溶性小分子物质。2. 实验目的：实验目的：探究在什么温度下使用加酶洗衣粉的洗涤探究在什么温度下使用加酶洗衣粉的洗涤效果最好效果最好探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果的洗涤效果探究添加不同种类酶的洗衣粉其洗涤效果探究添加不同种类酶的洗衣粉其洗涤效果有哪些区别有哪些区别.实验设计.结果分析与评价确定加酶洗衣粉的洗涤效果最好确定加酶洗衣粉的洗涤效果最好的最适温度的最适温度比较普

14、通洗衣粉和加酶洗衣粉洗比较普通洗衣粉和加酶洗衣粉洗涤效果涤效果分析各种不同品牌的加酶洗衣粉分析各种不同品牌的加酶洗衣粉对油渍、汗渍、血渍的洗涤效果对油渍、汗渍、血渍的洗涤效果1. 实验原理：酶在催化反应中易变性失活，反应后不易酶在催化反应中易变性失活，反应后不易回收再利用，提高成本，影响产品质量。回收再利用，提高成本，影响产品质量。将酶固定在将酶固定在不溶于水的载体不溶于水的载体上，既能与上，既能与反反应物接触应物接触，又能与，又能与产物分离产物分离，可，可回收反复回收反复利用。利用。酶是由酶是由细胞合成细胞合成的，直接固定的，直接固定合成酶的细合成酶的细胞胞，既操作简便，又可降低成本。，既操

15、作简便，又可降低成本。. 固定化细胞技术固定化酶：固定化酶：是指限制或固定于特定空是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体的说，指经物理或间位置的酶，具体的说，指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂作用的酶制剂u固定化细胞固定化技术：将细胞限制或定位于固定化技术：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定特定空间位置的方法称为细胞固定化技术化技术固定化细胞：被限制或定位于特定固定化细胞：被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞空间位置的细胞称为固定化细胞u酶固定的几种方式示

16、意图淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测本实验有吸附法将淀粉酶的固定在石英砂上。用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。三、DNA和蛋白质技术DNA的粗提取与鉴定多聚酶链式反应扩增DNA段 PCR体外扩增DNA技术血红蛋白的提取和分离1.实验原理：NaCl溶液浓度为溶液浓度为0.14mol/L时，时，DNA溶解度最低溶解度最低析出析出DNA；DNA不溶于酒精不溶于酒精提纯提纯DNA；DNA遇二苯胺遇二苯胺(沸水浴沸水浴)能被染成能被染成蓝色蓝色鉴定鉴定DNA. 实验设计：制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液柠檬酸钠柠檬酸钠提取血细胞的核物质提取血细胞的核物质蒸馏水蒸馏水溶解溶解DNA2

17、mol/LNaCl溶液溶液析出析出DNA0.14mol/LNaCl溶溶液液提纯提纯DNA95冷酒精冷酒精再溶解再溶解DNA2mol/LNaCl鉴定鉴定DNA二苯胺鉴定二苯胺鉴定3. 实验设计实验材料的选择实验材料的选择动物：鸡血动物：鸡血（不能选择哺乳动物的红细胞）（不能选择哺乳动物的红细胞）植物：菜花（用植物细胞作实验材料时植物：菜花（用植物细胞作实验材料时 需要先用洗涤剂溶解细胞膜）需要先用洗涤剂溶解细胞膜）提取提取DNA的基本思路：的基本思路：利用利用DNA与与RNA、蛋白质和脂质等在物、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分去除其

18、他成分uDNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离与蛋白质进一步分离uDNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响没有影响大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而的高温，而DNA在在80以上才会变性以上才会变性洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质白质,但对但对DNA没有影响没

19、有影响u操作步骤破碎细胞破碎细胞鸡血蒸馏水鸡血蒸馏水搅拌搅拌过滤过滤收集滤液收集滤液溶解溶解DNA并去掉滤液中杂质并去掉滤液中杂质2mol/LNaCl溶液滤液溶液滤液析出析出DNA2mol/LNaCl溶液蒸馏水溶液蒸馏水0.14mol/LNaClDNA析析出出再溶解再溶解DNA2mol/LnaCl溶液析出的溶液析出的DNA析出析出滤液滤液提纯提纯DNA： 95冷酒精滤液冷酒精滤液静置静置min出现白色丝状物出现白色丝状物鉴定鉴定DNA2mol/LnaCl溶液溶液mL白色丝状的白色丝状的物物mL二苯胺溶液二苯胺溶液沸水浴沸水浴min出现蓝色反应出现蓝色反应设置对照设置对照2mol/LnaCl溶液溶液mLmL二苯胺二苯胺溶液溶液沸水浴沸水浴min没有蓝色反应没有蓝色反应观察实验结果：观察实验结果：实验组与对照组是否变蓝实验组与对照组是否变蓝1. 实验原理：通过通过温度变化温度变化控制控制DNA的的变性变性和和复复性性，可将极微量的靶，可将极微量的靶DNA特异地扩增特异地扩增上百万倍上百万倍通过设计相应的通过设计相应的引物引物，加入，加入四种脱氧四种脱氧核苷酸核苷酸原料、原料、DNA模板、模板、TaqDNA聚合酶聚合酶(耐高耐高93高温高温)等，完成特定等，完成特定基因的基因的体外复制体外复制。u脱氧核苷酸结构式O OO OP PO OHO