荧光 光度分析法测定维生素B2---全ppt课件

1、一一 、概、概 述述 什么是荧光呢？当某些物质被光照射后，什么是荧光呢？当某些物质被光照射后，它会吸收一定频率的光，而发射出波长更长的它会吸收一定频率的光，而发射出波长更长的光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是荧光现象，它发出的光就叫荧光。第一次发现荧光现象，它发出的光就叫荧光。第一次发现荧光现象的是荧光现象的是1616世纪西班牙的内科医生和植物世纪西班牙的内科医生和植物学家莫纳德斯学家莫纳德斯 （N.MonardesN.Monardes）, , 在一种木头在一种木头切片的水溶液中，看到了极为可爱的天蓝色，切片的水溶液中，看到了极为可爱的天蓝色，以此

2、开始了荧光研究。以此开始了荧光研究。 直到直到18521852年在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比年在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波入射光的波长稍长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，才确立了荧光是光发射的概念。到长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，才确立了荧光是光发射的概念。到1919世纪末人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等世纪末人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600600种以上的荧光物质。种以上的荧光

3、物质。 20 20世纪以来，荧光现象被研究得更多了，发现了共振荧光、增感荧光，能够世纪以来，荧光现象被研究得更多了，发现了共振荧光、增感荧光，能够进行荧光产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定等等。进行荧光产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接测定等等。 当一些物质被光照射后，物质的分子吸收光以后，便以基态跃迁到激发态，成为激当一些物质被光照射后，物质的分子吸收光以后，便以基态跃迁到激发态，成为激发分子，然后通过相互碰撞或和其它溶剂分子碰撞等去活化的过程而消耗了能量，发分子，然后通过相互碰撞或和其它溶剂分子碰撞等去活化的过程而消耗了能量，回到第一激发态的最低振动能级，这种跃迁称为无辐射跃迁

4、，它不会发光。当电子回到第一激发态的最低振动能级，这种跃迁称为无辐射跃迁，它不会发光。当电子由激发态的最低振动能级跃迁回基态的不同振动能级时，则以荧光的形态发出能量。由激发态的最低振动能级跃迁回基态的不同振动能级时，则以荧光的形态发出能量。1. 1. 激激 发发 通常在室温下物质分子通常在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动大部分处于基态的最低振动能级（能级（ =0=0）。当电子吸）。当电子吸收一定频率的电磁辐射发生收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升至不同能级跃迁时，可上升至不同激发态的各振动能级，其中激发态的各振动能级，其中大部分分子上升至第一激发大部分分子上升至第一激发单重态（单

5、重态（ S S1 1 ），这一过程），这一过程称为激发。称为激发。2.2.去活化过程去活化过程 处于激发态的分子是不稳定，它可以通过处于激发态的分子是不稳定，它可以通过不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。去活化过程有以下几种：去活化过程有以下几种： （1 1）振动驰豫）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很溶液中分子间碰撞机会很多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最低振动能级，这一过程称为振动驰豫。低振动能级，这一过程称为振动驰豫。 （

6、2）内部转换）内部转换 同一多重态的不同电子能级间可能发同一多重态的不同电子能级间可能发生内部转换。生内部转换。 S2 S1或或T2 T1 条件：当条件：当S2较低振动能级与较低振动能级与S1较高振较高振动能级的能量相当，且发生重叠时分子动能级的能量相当，且发生重叠时分子才有可能才有可能S2 S1或或T2 T1 （3 3）荧光发射）荧光发射 处于第一激发的处于第一激发的最低振动能级的分最低振动能级的分子，跃迁回基态的子，跃迁回基态的各振动能级，这一各振动能级，这一过程称为荧光发射。过程称为荧光发射。 （4 4）体系间跨越跃迁）体系间跨越跃迁 分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程，称体

7、系间跨越跃迁。分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程，称体系间跨越跃迁。 三重态：电子自旋方向相同三重态：电子自旋方向相同 单重态单重态: : 电子自旋方向相反电子自旋方向相反 这些分子从第一激发三重态的最低振动能级下降至第一基态的各振动能级，所发这些分子从第一激发三重态的最低振动能级下降至第一基态的各振动能级，所发出的辐射即为磷光。出的辐射即为磷光。1.激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激发光谱和发射光谱发光谱和发射光谱（1 1）激发光谱）激发光谱 绘制激发光谱时，固定荧光的最大发射波绘制激发光谱时，固定荧光的

8、最大发射波长，然后改变激发光的波长，所测得的荧光强长，然后改变激发光的波长，所测得的荧光强度与激发波长的谱线关系即为激发光谱。度与激发波长的谱线关系即为激发光谱。三、荧光的特性三、荧光的特性 （2 2）发射光谱）发射光谱 发射光谱简称荧光光谱。发射光谱简称荧光光谱。绘制发射光谱绘制发射光谱时，固定荧光的最大激发波长，然后改变发射时，固定荧光的最大激发波长，然后改变发射光的波长，所测得的荧光强度与发射波长的谱光的波长，所测得的荧光强度与发射波长的谱线关系即为发射光谱。线关系即为发射光谱。2.2.荧光光谱形状与激发波长无关荧光光谱形状与激发波长无关 由于分子无论被激发到高于由于分子无论被激发到高于

9、S S1 1哪一个激发哪一个激发态，都经过无辐射的振动驰豫或内部转换等过态，都经过无辐射的振动驰豫或内部转换等过程，最终回到程，最终回到S S1 1态的最低振动能级，然后跃迁态的最低振动能级，然后跃迁回基态产生荧光。回基态产生荧光。3.3.吸收光谱和荧光光谱有很好的镜像关系吸收光谱和荧光光谱有很好的镜像关系 由于分子的由于分子的S S0 0态和态和S S1 1态中各振动能级的能量分态中各振动能级的能量分布情况相似决定的。因此吸收光谱和发射光谱的形布情况相似决定的。因此吸收光谱和发射光谱的形状相似。状相似。蒽的吸收光谱和发射光谱蒽的吸收光谱和发射光谱 吸收光谱吸收光谱 发射光谱发射光谱 （）发光

10、分子中要具有共轭（）发光分子中要具有共轭键体系键体系 共轭的程度越大，共轭的程度越大， 电子越容易激发，分子电子越容易激发，分子放光越容易产生。放光越容易产生。 （2 2）具有刚性平面结构分子有利于荧光发射）具有刚性平面结构分子有利于荧光发射 分子的共平面越大，其分子的共平面越大，其 电子的共轭程度越大。如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光电子的共轭程度越大。如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素有很强的荧光，而酚酞没有，这是由于荧光素有刚性平面结构，减少了分子振动，减素有很强的荧光，而酚酞没有，这是由于荧光素有刚性平面结构，减少了分子振动，减少了去活化的概率。少了去活化的概率。OH, OH, NH2

11、,NH2,NHR,NHR,NR2,NR2,CNCN 吸电子基减弱荧光：吸电子基减弱荧光：Br , Br , Cl , Cl , NO2,NO2, N NN, N, COOHCOOH 1. 1.荧光的减退荧光的减退 荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化作用，会使荧光逐渐减退作用，会使荧光逐渐减退。2.2.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 在稀溶液中：在稀溶液中： F FKcKc F F 为荧光强度为荧光强度 K K检测效率（由仪器决定）检测效率（由仪器决定） c c 为液体的浓度为液体的浓度c 高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使高浓

12、度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F F与与c c不呈线性关系不呈线性关系3.3.温度的影响温度的影响 温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则荧光强度下降。荧光强度下降。 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族

13、化合物的荧光一般都与溶液合物的荧光一般都与溶液PHPH值有关，例如：在值有关，例如：在pH=712pH=712的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光；而在蓝色荧光；而在pH2pH13pH13的溶液中苯胺以离的溶液中苯胺以离子形式存在，都不会发出荧光。同时所用酸的种子形式存在，都不会发出荧光。同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。的荧光比在盐酸中的要强。4. pH4. pH的影响的影响 许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇溶液中的荧光比在水

14、溶液中强。乙醇、甘油、溶液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀释，或加入一部分水。释，或加入一部分水。5.5.溶溶 剂剂 6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同荧光强度达到最高点所需要的时间不同，有，有的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。有的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。有的反应需要经过的反应需要经过15301530分钟才能达到最高峰。分钟才能达到最高峰。 7. 7.有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏法提纯。橡皮塞、软木

15、塞及滤纸中也常有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏法提纯。橡皮塞、软木塞及滤纸中也常有能溶于溶剂的一些带荧光的物质。有能溶于溶剂的一些带荧光的物质。 包括有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。包括有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。六、荧光分析仪器的基本组成部件荧光分析仪器的基本组成部件 激发光源应具有足够的强度、适用波长范围激发光源应具有足够的强度、适用波长范围宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧灯。灯。 氙弧灯氙弧灯又称又称氙灯，是目前荧光分光分度计中氙灯，是目前荧光分光分度计中 应用最广泛的一种光源。它是

16、一种短弧气体放电应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，光强度大氙灯的灯灯，外套为石英，内充氙气，光强度大氙灯的灯内气压高，启动时的电压高（内气压高，启动时的电压高（2040KV2040KV）, ,因此使因此使用时一定要注意安全。用时一定要注意安全。1. 1. 激发光源激发光源 荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器 单色器有两块：单色器有两块： 第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长；第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长； 第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。 一般后者

17、的光栅闪耀波长比前者来得长一些。一般后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。 第一滤光片用以分离出所需用的激发光，第二滤第一滤光片用以分离出所需用的激发光，第二滤光片用以滤去杂散光、拉曼光和杂质所发射的荧光。光片用以滤去杂散光、拉曼光和杂质所发射的荧光。 2. 2. 单色器单色器 荧光分析的比色皿通常用石英材料做成，荧光比色皿四面均为磨光透明面，同时荧光分析的比色皿通常用石英材料做成，荧光比色皿四面均为磨光透明面，同时一般仅有一种厚度为一般仅有一种厚度为1cm1cm的液池。的液池。 3.3.样品池样品池 荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，荧光计多采用光电倍增管进行

18、检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。荧光仪的读出装置有数字电压表或记录仪。现代仪器都配上计算机，进行自动控制荧光仪的读出装置有数字电压表或记录仪。现代仪器都配上计算机，进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数。和显示荧光光谱及各种参数。 光源光源样本池第一（激发）第一（激发） 单色器单色器第二（发射）单色器第二（发射）单色器检验器检验器显示、记录装置显示、记录装置1.1.标准曲线法标准曲线法 将已知量的标准物经过与试样相同的处理将已知量的标准物经过与试样相同的处理后，配成一定浓度的标准溶液，并测定他们的后，配成一定浓度的

19、标准溶液，并测定他们的荧光强度，绘制一条以荧光强度和标准溶液浓荧光强度，绘制一条以荧光强度和标准溶液浓度的标准曲线，然后测定未知样的浓度。度的标准曲线，然后测定未知样的浓度。（2 2）荧光猝灭法）荧光猝灭法 在一般荧光分析中，荧光的猝灭现象是不在一般荧光分析中，荧光的猝灭现象是不可避免的，但是我们可以利用猝灭现象，进行可避免的，但是我们可以利用猝灭现象，进行荧光分析。例如一物质本身不会发光，也不会荧光分析。例如一物质本身不会发光，也不会与其它物质形成荧光物质，但它会使另外一种与其它物质形成荧光物质，但它会使另外一种会发射荧光的物质荧光强度降低，荧光强度的会发射荧光的物质荧光强度降低，荧光强度的

20、下降程度与该物质的浓度成比例，此法成为荧下降程度与该物质的浓度成比例，此法成为荧光猝灭法。光猝灭法。 1. 1.特特 点点 灵敏度高灵敏度高：测定下限0.10.001 gmL-1,比分光光度法高2 24 4个数量级. . 仪器设备相对简单、仪器设备相对简单、 体积小体积小 操作较简便操作较简便 反应时间也较快反应时间也较快 八、荧光分析法的特点及应用八、荧光分析法的特点及应用 生物化学分析、生理医学研究、临床检测生物化学分析、生理医学研究、临床检测（1)1)直接测定能产生荧光的物质直接测定能产生荧光的物质 带苯环带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸 (

21、2)(2)测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质物质 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光 (3)(3)荧光熄灭法测定猝灭剂荧光熄灭法测定猝灭剂2.2.荧光光度法的应用荧光光度法的应用1.1.学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法2 2. .学会使用荧光分光度计学会使用荧光分光度计一、实验目的：一、实验目的： 化学名：化学名：7,8-7,8-二甲基二甲基1010(2S,3S,4R) - (2S,3S,4R)

22、- 2,3,4,5-2,3,4,5-四羟基戊基苯并蝶啶四羟基戊基苯并蝶啶-2,4-2,4（3H3H， 10H10H）- -二酮二酮 分子式：分子式：C C1717H H2020N N4 4O O6 6 分子量：分子量：376.36 376.36 三、实验仪器三、实验仪器RF-5301PCRF-5301PC荧光光度计荧光光度计 日本岛津公司日本岛津公司 1.1.仪器介绍仪器介绍 拥有世界最高水平的拥有世界最高水平的S/NS/N，可达到，可达到150150以上。最适合高灵敏度、高分辨率测以上。最适合高灵敏度、高分辨率测定。其主要参数和特点定。其主要参数和特点 测定范围：测定范围：220900nm2

23、20900nm 带带 宽：宽：1.51.5、3 3、5 5、1010、20nm20nm 灵敏度：灵敏度：S/N150S/N150 测定方式：定性分析、同步光谱分析、定量分析、时间过程测定。测定方式：定性分析、同步光谱分析、定量分析、时间过程测定。打开电脑和打开电脑和RF-5301RF-5301系统的开关，点击桌面的系统的开关，点击桌面的RF-5301RF-5301的快捷图标，启动仪器的控制程的快捷图标，启动仪器的控制程序序从从“Acquire ModeAcquire Mode”菜单中选菜单中选SpectrumSpectrum光谱光谱 ，进入光谱模式。，进入光谱模式。2.2.操作规程操作规程从从

24、“ConfigureConfigure设置设置”菜单中选择菜单中选择ParametersParameters参数参数 若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激发波长未知，则在上述对话框中设置合适的激发发波长未知，则在上述对话框中设置合适的激发发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计按发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计按键中点击键中点击 ，在弹出的对话框中选择激发光，在弹出的对话框中选择激发光和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点“SearchSearch”键，等待一段时间，由仪器键，等待一段时间，由仪器给出给出

25、最优波长。最优波长。 设置激发发射光波长，激发发射狭缝宽度，灵敏度，设置激发发射光波长，激发发射狭缝宽度，灵敏度，反应时间，单位，浓度以及强度范围。反应时间，单位，浓度以及强度范围。将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点击将装有蒸馏水的样品池放入池槽中，点击“ “ ”自动回零。自动回零。 将第一个标准样品装入池槽中，点击将第一个标准样品装入池槽中，点击 弹出如下对话框，弹出如下对话框，输入标准样品的浓度输入标准样品的浓度 以此测完以此测完5 5个标准样品后，屏幕上会个标准样品后，屏幕上会出现工作曲线，也会出现标准曲线方程。出现工作曲线，也会出现标准曲线方程。 在工作曲线绘制完成后，可以定量测定未知

26、样的浓度，点击在工作曲线绘制完成后，可以定量测定未知样的浓度，点击 。然后将未知样品。然后将未知样品放入池槽中，点击放入池槽中，点击 开始浓度的测定。开始浓度的测定。最后，在最后，在FileFile菜单中选择菜单中选择SaveSave，储存获得的数据，储存获得的数据 1. 1. 10.0 gmL-1核黄素标准溶液的配制：核黄素标准溶液的配制： 称取称取0.01g0.01g核黄素置于核黄素置于50mL50mL烧杯中，以烧杯中，以蒸馏水溶解后，定溶于蒸馏水溶解后，定溶于1000mL1000mL容量瓶中，摇容量瓶中，摇匀，备用。匀，备用。 四、实验试剂四、实验试剂1.1.配制系列标准溶液配制系列标准溶液取取4 4个个 50 ml50 ml容量瓶，分别加入容量瓶，分别加入 1.001.00，2.002.00，3.003.00，4.00 ml4.00 ml核黄素标准溶液，用水稀释至刻度，核黄素标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀。摇匀。2.2.扫描扫描核黄素的最大核黄素的最大激发波长和发射波长激发波长和发射波长 对对核黄素标准溶液进行荧光扫描，根据核黄素标准溶液进行荧光扫描，根据激发光谱激发光谱曲线和发射光谱曲线，确定最大激发波长和最大发射曲线和发射光谱曲线，确定最大激发波长和最大发射波长。波长