蛋白质组学研究方法

1、XXXXXXXX2015-11-27蛋白质组学研究方法蛋白质组学研究方法1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介 概概 要要3. 质谱分析鉴定质谱分析鉴定2. 蛋白质的分离蛋白质的分离组学时代（组学时代（Age of omics）1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介从基因组学到蛋白质组学从基因组学到蛋白质组学1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介什么是蛋白质组（学）？什么是蛋白质组（学）？ 蛋白质组蛋白质组(proteome = protein + genome)：一种细胞、组织或生物体所表：一种细胞、组织或生物体所表达的全套蛋白质，具整体性和动态性。达的全套蛋白质，具整体性和动态性。 蛋白质组学蛋白质组

2、学(proteomics) ：研究细胞组织或生物体蛋白质组成及其变化：研究细胞组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。规律的科学。1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介Tip：蛋白质组学是研究领域和方向：蛋白质组学是研究领域和方向，也是研究工具和策略，也是研究工具和策略蛋白质组学研究思路蛋白质组学研究思路 表达蛋白质组表达蛋白质组 功能蛋白质组功能蛋白质组 蛋白质与蛋白质的相互作用蛋白质与蛋白质的相互作用 结构蛋白质结构蛋白质组组 蛋白质组与基因组、转录组、糖组、代谢组间的相互关系蛋白质组与基因组、转录组、糖组、代谢组间的相互关系1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介蛋白质调控及功能实现的复杂性蛋白

3、质调控及功能实现的复杂性mRNAProteinRibosomeDNAPolypeptidetRNA1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介蛋白质组学研究特点蛋白质组学研究特点1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介蛋白质组学研究内容蛋白质组学研究内容1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介蛋白质组学研究常用技术蛋白质组学研究常用技术1. 蛋白质组学简介蛋白质组学简介蛋白质的分离策略蛋白质的分离策略2. 蛋白质的分离蛋白质的分离总蛋白质的提取（植物）总蛋白质的提取（植物） 三氯乙酸（三氯乙酸（TCA）-丙酮法丙酮法 苯酚苯酚法法 裂解液裂解液法法 尿素尿素/硫脲硫脲法法 KCl-醋酸铵甲醇醋酸铵甲醇法法 改良改良

4、丙酮沉降丙酮沉降法法 硫酸铵硫酸铵沉降沉降法法 直接直接提取法提取法等等 2. 蛋白质的分离蛋白质的分离等电聚焦（等电聚焦（Isoelectric focusing, IEF） 原理：根据蛋白质的等电点进行蛋白分离原理：根据蛋白质的等电点进行蛋白分离2. 蛋白质的分离蛋白质的分离固相固相pH梯度梯度(Immobilized pH gradiet, IPG)胶胶 在在IPG胶胶中，丙烯酰胺缓冲中，丙烯酰胺缓冲液通过液通过乙烯键共价聚合乙烯键共价聚合至固体凝胶聚丙至固体凝胶聚丙烯酰胺烯酰胺骨架中而形成骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电不会发生电渗透作用

5、，因而渗透作用，因而可进行稳定可进行稳定的的IEF分离达到真正的平衡状态。分离达到真正的平衡状态。 丙烯酰胺缓冲液丙烯酰胺缓冲液: CH2=CH-CO-NH-R,R ：羧基或叔胺基：羧基或叔胺基固相凝胶固相凝胶2. 蛋白质的分离蛋白质的分离不同不同pH和长度的和长度的IPG胶胶（以（以BIO-RAD的的ReadyStrip IPG 胶条为例）胶条为例）相对聚焦功率表示在使用不同长度或相对聚焦功率表示在使用不同长度或 pH 范围的范围的 IPG 胶条时，在第一维中预期获得的增强的分辨率。胶条时，在第一维中预期获得的增强的分辨率。 为为 7 cm pH 310 IPG 胶条任意分配基线聚焦功率胶条

6、任意分配基线聚焦功率 1.0 以便计算其他胶条的相对聚焦功率以便计算其他胶条的相对聚焦功率2. 蛋白质的分离蛋白质的分离宽宽pH、窄、窄pH 范围胶条范围胶条 宽宽pH梯度胶条梯度胶条应用：应用：整个整个蛋白图谱蛋白图谱 窄窄pH梯度胶条梯度胶条应用：应用：提高提高分辨率分辨率增加增加样品上样量样品上样量检测检测分析更多蛋白分析更多蛋白2. 蛋白质的分离蛋白质的分离SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳) 根据蛋白质根据蛋白质的分子的分子量进行蛋白量进行蛋白分离。分离。 同普通同普通SDS-PAGE类似，类似，只是只是一般一般在在垂直电泳系统中无垂直电泳系统中无需浓缩

7、需浓缩胶。胶。2. 蛋白质的分离蛋白质的分离2-DE实验操作实验操作2. 蛋白质的分离蛋白质的分离蛋白质检测蛋白质检测适用于质适用于质谱的染色谱的染色方法方法 考马斯亮考马斯亮兰染色兰染色 ：灵敏度为灵敏度为10-30 ng，所需试剂少，操作简便，无毒性，染，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。好。 银染：银染：灵敏度为灵敏度为200pg，但其线性很差。，但其线性很差。普通银普通银染过程中因醛类的特异反应，染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。而与下游质谱不兼容。 荧光染色：荧光染色：SYPRO染料

8、，与银染相比灵敏度相当，操作简便；但价格昂贵。染料，与银染相比灵敏度相当，操作简便；但价格昂贵。2. 蛋白质的分离蛋白质的分离电泳图谱分析电泳图谱分析典型流程典型流程 凝胶图像的凝胶图像的扫描扫描 图像图像加工加工 斑点检测和斑点检测和定量定量 凝胶凝胶配比配比 数据分析数据分析 数据呈递和数据呈递和解释解释 2-DE数据库的建立数据库的建立常用软件常用软件 PDQuest ImageMaster 2D Elite (MelanieTM)2. 蛋白质的分离蛋白质的分离感兴趣蛋白点的切取感兴趣蛋白点的切取 灭菌灭菌的的0.2 ml枪头前端枪头前端剪剪去去2cm左右左右，用此枪用此枪头头垂直戳向凝

9、胶垂直戳向凝胶上的蛋白点，旋转枪头直至将上的蛋白点，旋转枪头直至将胶点取下胶点取下。注意避免污染。注意避免污染。2. 蛋白质的分离蛋白质的分离双向凝胶电泳（双向凝胶电泳（2-DE）优缺点）优缺点优点：优点： 分离能分离能力高，技术比较成熟力高，技术比较成熟 可同时提供等电点和分子量信息可同时提供等电点和分子量信息缺点缺点： 不易获得低丰富度或者特殊（过酸、不易获得低丰富度或者特殊（过酸、过碱、难溶膜蛋白等）的蛋白过碱、难溶膜蛋白等）的蛋白 操作繁琐，难以实现自动化操作繁琐，难以实现自动化2. 蛋白质的分离蛋白质的分离荧光差异双向电泳荧光差异双向电泳(2D-DIGE) 在传统在传统2-DE基础上

10、基础上引入三种荧光标记引入三种荧光标记(Cy2、Cy3和和Cy5)分别对内标（各样品分别对内标（各样品的等量混合）和样品进行标记，的等量混合）和样品进行标记，实现不实现不同蛋白样品同蛋白样品的同时的同时分离分离、单独成像、提、单独成像、提高高了重复性及结果的了重复性及结果的可靠性。可靠性。2. 蛋白质的分离蛋白质的分离2D-DIGE中内标的重要性中内标的重要性 以以样品中的蛋白点与其内标的比值样品中的蛋白点与其内标的比值作为其定量数据作为其定量数据 使使不同凝胶之间的点的分析和定量不同凝胶之间的点的分析和定量更加更加精确精确 使使不同凝胶之间的匹配更加不同凝胶之间的匹配更加可信可信 使使实验间

11、的误差与样品之间的差异实验间的误差与样品之间的差异区分开来区分开来分析说明：分析说明：1)在没有内标的情况下，我们通过在没有内标的情况下，我们通过AB两块胶的分析，两块胶的分析，会得出结论：会得出结论： 图中红色圆环所标记的蛋白质点在处理图中红色圆环所标记的蛋白质点在处理组组(样品样品3和样品和样品4)表达量增高；表达量增高；2)通过内标的校正，我们可以证明，这实际上是由凝通过内标的校正，我们可以证明，这实际上是由凝胶之间的误差造成的，并不是样品之间的真实差异。胶之间的误差造成的，并不是样品之间的真实差异。2. 蛋白质的分离蛋白质的分离多维液相色谱多维液相色谱 亲和色谱（亲和色谱（AC） 离子

12、交换色谱（离子交换色谱（IEC） 反相高效液相色谱（反相高效液相色谱（RP-HPLC） 顺序使用基于不同物理化学分离原理的顺序使用基于不同物理化学分离原理的多种色谱技术能够为复杂蛋白质或多肽混合多种色谱技术能够为复杂蛋白质或多肽混合物的分析提供足够分辨率，并能够直接同质物的分析提供足够分辨率，并能够直接同质谱仪连用，实现样品制备分离到质谱鉴定的谱仪连用，实现样品制备分离到质谱鉴定的自动化。或者色谱技术与自动化。或者色谱技术与2-DE结合使用。结合使用。起始材料起始材料蛋白质的溶解蛋白质的溶解酶解消化酶解消化肽段混合物肽段混合物亲和色谱富集（亲和色谱富集（AC）第一维：第一维：IEC第二维：第二

13、维：RP-HPLCESI-MSESI-MS/MS收收 集集组组 分分2. 蛋白质的分离蛋白质的分离iTRAQ标记定量技术标记定量技术 iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation,同位素标记同位素标记相对与相对与绝对定量技术）技术是由绝对定量技术）技术是由ABI公司于公司于2004年开发，年开发，其标签试剂可与氨基（其标签试剂可与氨基（包括包括氨基酸氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）反应实现端及赖氨酸侧链氨基）反应实现连接连接。 最多可标记八种不同样品最多可标记八种不同样品，蛋白，蛋白覆盖率高，定量准确覆盖率高，定量准确，可信度

14、，可信度高，数据高，数据丰富。丰富。2. 蛋白质的分离蛋白质的分离iTRAQ标记试剂标记试剂2. 蛋白质的分离蛋白质的分离iTRAQ标记定量原理标记定量原理2. 蛋白质的分离蛋白质的分离iTRAQ操作流程操作流程2. 蛋白质的分离蛋白质的分离iTRAQ技术特点技术特点 通量高通量高：可一次实现最多可一次实现最多8次样品的分离分析次样品的分离分析 重复性重复性好且定量准确好且定量准确：所有样品的分离鉴定条件完全一致所有样品的分离鉴定条件完全一致，保证，保证了实验重了实验重复性，同时增强定量的准确性复性，同时增强定量的准确性 分辨率分辨率高高：可与最高分辨率的可与最高分辨率的LC-MSMS技术结合

15、，实现技术结合，实现对低对低丰度蛋白的定丰度蛋白的定量定性量定性 数据数据丰富丰富：可以获得检测到的所有蛋白的定性和定量信息可以获得检测到的所有蛋白的定性和定量信息 自动化自动化程度高程度高：以以高分辨率高分辨率液质联用为基础，自动化操作液质联用为基础，自动化操作，分析，分析速度快速度快2. 蛋白质的分离蛋白质的分离质谱（质谱（MS）鉴定）鉴定 质谱仪：能够测量真空中离子的质荷比（质谱仪：能够测量真空中离子的质荷比（m/z）的仪器）的仪器 根据根据m/z可以准确确定待测样品的分子质量，从而确定其分子组成可以准确确定待测样品的分子质量，从而确定其分子组成质谱仪的主要构成质谱仪的主要构成3. 质谱

16、分析鉴定质谱分析鉴定蛋白质组学中常用的质谱仪蛋白质组学中常用的质谱仪 ESI-三重四级杆三重四级杆 MS LC-ESI-MS/MS MADLI-TOF (/TOF) MS：价格便宜，应用最广泛：价格便宜，应用最广泛 Orbitrap MS：新技术，更高的：新技术，更高的质量分辨率质量分辨率和质量和质量精度精度3. 质谱分析鉴定质谱分析鉴定质量指纹图谱质量指纹图谱 肽质量指纹图谱（肽质量指纹图谱（PMF）：蛋白质被具有特异性切割位点的蛋白酶降解后产）：蛋白质被具有特异性切割位点的蛋白酶降解后产生的多肽的质量通过生的多肽的质量通过MS进行测定得到进行测定得到MS图谱。由于每个蛋白质所含氨基酸序图谱

17、。由于每个蛋白质所含氨基酸序列不同，因此其列不同，因此其PMF也是独一无二的。也是独一无二的。 MS/MS(串联质谱串联质谱) 蛋白鉴定：在蛋白鉴定：在PMF基础上选择基础上选择部分部分片段进行破碎并获得碎片段进行破碎并获得碎片质量图谱与理论图谱片质量图谱与理论图谱进行比较进行比较实现蛋白匹配实现蛋白匹配鉴定。鉴定。3. 质谱分析鉴定质谱分析鉴定基于质量指纹图谱鉴定蛋白质基于质量指纹图谱鉴定蛋白质 通过将实验测得通过将实验测得的的质量图谱质量图谱在在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽谱的蛋白质。肽谱的蛋白质。3. 质谱分析鉴定质谱分析鉴定数据库检索数据库检索3. 质谱