实例图解简并引物设计

1、a1a2实例图解简并引物设计实例图解简并引物设计一、序言设计一对合适的引物是PCR 扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成，却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y 病毒CP 基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、同学批评指正。二、相关工具ME

2、GA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑；DNAMAN8-检测两引物的互补性；Oligo Calc-评估引物的属性；1.Web Logo 3-直观显示简并碱基。a3三、基本原则设计一对好的引物，归结起来就是 5端引物、3端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：两引物的序列要与模板的序列紧密互补；两引物不能在模板的非目的位点发生错配；两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。四、延伸原则引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应；GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的 GC 含量相差不能过于悬殊；1.

3、 碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的 GC，GC 富集区容易导致错误引发反应。a4五、特别注意5端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从3端开始的，所以 3端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3端引物时，需要综合考虑以下几个内容：不要终止于密码子的第 3 位；末位碱基避免使用碱基 A；避免出现3 个以上连续的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG；G 的绝对值不可超过 9；与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8 个互补碱基源；1.不能进行任何修饰。a5六、设计流程a6七、示例背景马铃薯Y 病毒（Potato viru

4、s Y，PVY）是侵染马铃薯、烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生，单一的特异性引物无法适应PVY 不同株系的检测需求，需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。a7八、详细图解1. 序列准备：序列准备：（1）GenBank 下载PVY 全基因组序列；（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对；（3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：a8 先将光标定位在第一条序列任意位置，然后

5、在左下角Site处直接输入 C P 基 因 上 游 分 界 点 位 置 （ 8 3 9 1 ） 后 回 车 。 接 着 点 击“Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。a9 裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment”导出CP 基因序列（推荐fasta 格式）。a102. 引物设计引物设计推荐先设计3端引物，至于原因，上面的【特别注意】中已提到，这里不再赘述。（1）选择引物序列）选择引物序列综合考虑引物设计原则及特别注意，在CP 基因3端位置选取一段合适

6、的序列（784-803bp），804bp 位置为A 且是第三个密码子位置，所以弃去末位的 A 碱基。a11 PS：是否位于密码子的第3 位，可以通过“ Tr a n l a t e d P r o t e i n Sequences”-“DNA sequences”切换查看，如右图，CP 基因的末端3 个碱基是终止密码子所在的位置，A 是第三位密码子。a12（2）生成）生成 Seq Logo选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序列，保留CP 基因3端序列，同样导出为Fasta文件，将序列粘贴入Web Logo3的文本框内或直接上传序列文件，设置相关参数后点击“Create”生成 Seq Logo

7、 格式的文件。参数设置：参数设置： “Output format”（输出格式）推荐用“PDF”，“Color scheme”（颜色方案）推荐用“Classic (NA)”，设 置 完 毕 ， 点 击 右 下 角 “ C r e a t e Logo“即可得下图的Seq Logo 格式文件。a13通过Web Logo 生成的多重比对图片可以很直观得到3端序列为CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG，查询简并碱基代码表（下图），可知C/T/G=B，G/A=R，简 并 度 = 3 2 = 6 ， 整 理 后 3 端 序 列 为 CTTGGAGTBAARAACATGTG，故而需要

8、合成的3端引物序列： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与原序列是反向互补关系）。简并碱基代码代码碱基代码碱基RA, GYC, TKG, TSG, CMA, CWA, TBG, C, TVA, G, CDA, G, THA, C, TNA, G, C, Ta143. 质量评估质量评估（1）参数评估将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内，按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长度、GC 含量、Tm 值等信息。（2）自身互补性（Check Self-Complementarity）点击“Check Self-Complementarity”，检测引

9、物自身互补性，主要查看“Potential hairpin formation”、“3 Complementarity”、“All potential self-annealing sites are marked in red (allowing 1 mis-match)”下方显示内容，如果三项均为“none”，则说明引物自身不会形成发夹结构且引物自身不会互补，引物没问题！a15a16（3）BLAST 比对回检比对回检点击“Blast”可以对引物进行BLAST 比对检测，结果显示，都是PVY CP 基因相关的序列，表明所设计的引物特异性良好。a17a18（4）两引物互补性检查）两引物互补性检

10、查 同样方式，得到5端序列：GSAAAYGAYACAATYGATGC，根据引物设计原则，需要检测两引物之间是否存在序列互补。 打开DNAMAN，依次在“Primer”-“Load primer”，粘贴任意一端引物序列，如：5端序列-GSAAAYGAYACAATYGATGC，确定。a19a20 接 着 ， 在 “ P r i m e r ” - “ T w o p r i m e r s Complementarity”-“Second Primer From Input”，粘贴入另一端序列，这里为3端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG，如下图：a21 结果显示，两引物间仅有3

11、个碱基互补，且自由能仅为1.8 Kcal/mol。a22（5）实验验证）实验验证PCR 扩增采用的 50L 反应体系为：10 TransTaq HiFi Buffer II 5 L，2.5nM dNTPs 4 L， 5端引物（10 mol/L）2 L，3端引物（10 mol/L）2 L，ddH2O 34.75 L，TransTaq HiFi Polymerase（5 U/L）0.25 L，cDNA 2 L。PCR 扩增程序条件为：94预变性5min，94变性30s，55复性30s，72延伸1min，共30 个循环，最后一轮循环后72延伸10min。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，如下图所示：a23 M.DNA 分子量标准（100bp）；泳道1-5：PVY 的不同株系（C、O、N、NTN、N-Wi）；泳道6-7：阴性对照（健康马铃薯）和空白对照；泳道8-12：PVX、PVM、PVA、PVS、PLRVa24九、延伸阅读九、延伸阅读 1 吴祖建, 高芳銮, 沈建国. 生物信息学分析实践.