基因芯片在海洋微生物中的应用

1、基因芯基因芯片在海洋生物中的应用片在海洋生物中的应用杨宝军一、基因芯片一、基因芯片 1.1 基因芯片的应用前景及领域基因芯片的应用前景及领域 1.2 基因芯片的概念和原理基因芯片的概念和原理 1.3 基因芯片的特性基因芯片的特性 1.4 基因芯片的分类基因芯片的分类1.1 基因芯片的应用前景及领域基因芯片的应用前景及领域 基因芯片技术已在生命科学众多领域显示出巨基因芯片技术已在生命科学众多领域显示出巨大的潜力与诱人的前景大的潜力与诱人的前景, 被认为是继基因克隆被认为是继基因克隆技术、基因测序技术和技术、基因测序技术和PCR技术后的又一次革技术后的又一次革命性技术突破命性技术突破 。 如在生物

2、制药领域、环境医学领域、分子生物如在生物制药领域、环境医学领域、分子生物学研究领域和医学临床检验领域就显示出强大学研究领域和医学临床检验领域就显示出强大的生命力。其中关键就是其具有集约化、标准的生命力。其中关键就是其具有集约化、标准化、微型化的特点化、微型化的特点 , 从而有可能实现从而有可能实现“将整个将整个实验室微缩到一片芯片上实验室微缩到一片芯片上”的愿望。的愿望。1.2 基因芯片的概念和原理基因芯片的概念和原理 基因芯片基因芯片(gene chip)属于生物芯片的一种属于生物芯片的一种, 又称又称DNA芯片芯片(DNA chip)、DNA微阵列微阵列(DNA microarray)或或

3、寡核苷酸寡核苷酸微阵列微阵列(oligonucleotide microarray),实实际上就是以特定的排列方式固定有大量际上就是以特定的排列方式固定有大量寡核寡核苷酸、苷酸、cDNA或或DNA片段的载片段的载体。体。 其原理是根据核酸的分子杂其原理是根据核酸的分子杂交衍交衍生而来生而来, 它将众多它将众多具有特异性的寡核苷酸片段或具有特异性的寡核苷酸片段或基因基因片段按照一定片段按照一定方式规则地固定于玻璃片、硅片、方式规则地固定于玻璃片、硅片、陶瓷陶瓷等固相支等固相支持物表面持物表面,再再与标记的样品分子进行杂交与标记的样品分子进行杂交, 通过对通过对杂交信号的检测分析获取各样品靶分子的

4、数量和杂交信号的检测分析获取各样品靶分子的数量和序列信息。序列信息。 用作基因芯片载体的材料有玻片、硅片、瓷片、聚用作基因芯片载体的材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜等。其丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜等。其中中最常用的最常用的是玻片。为确保实验中探针能够牢固的固定于载体是玻片。为确保实验中探针能够牢固的固定于载体上，通常在载体表面进行多聚赖氨酸修饰、醛基修上，通常在载体表面进行多聚赖氨酸修饰、醛基修饰、氨基修饰、巯基修饰等，使载体具有生物特异饰、氨基修饰、巯基修饰等，使载体具有生物特异性的亲和表面。最后将制备好的探针固定到活化的性的亲和表面。最后将制备好的探针固定到活化的基

5、片上，放入适宜的条件下，使之发生核酸杂交反基片上，放入适宜的条件下，使之发生核酸杂交反应。应。 芯片荧光标记物不同，检测荧光信号的方法也不尽芯片荧光标记物不同，检测荧光信号的方法也不尽相同。目前主要的荧光信号检测方法有荧光染料法、相同。目前主要的荧光信号检测方法有荧光染料法、放射性核素法、生物素法。我们通常所用的是以玻放射性核素法、生物素法。我们通常所用的是以玻片为载体的芯片，而与之对应的常用的荧光信号检片为载体的芯片，而与之对应的常用的荧光信号检测方法是荧光染料法。与之相对应的荧光检测装置测方法是荧光染料法。与之相对应的荧光检测装置有激光共聚焦显微镜、激光扫描荧光显微镜、激光有激光共聚焦显微

6、镜、激光扫描荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等。其中激光共聚焦扫描仪已经发展共聚焦扫描仪等。其中激光共聚焦扫描仪已经发展成为基因芯片的配套检测系统成为基因芯片的配套检测系统。芯片制作芯片制作被测试样品处理被测试样品处理探针在基质上的点探针在基质上的点入或原位合成入或原位合成靶分子的富集和标靶分子的富集和标记记( 基因转基因转录、录、m R N A 逆转逆转录或录或P C R 扩增扩增)探针阵列与标探针阵列与标记靶记靶核酸的杂交核酸的杂交激光共聚焦扫激光共聚焦扫描采描采集杂交信息集杂交信息数据处理，信息分析数据处理，信息分析1.3 基因芯片的特性基因芯片的特性 这一技术明显的特性就是将生物化学分析这

7、一技术明显的特性就是将生物化学分析系系统进统进行微缩行微缩, 集中分析实现高通量、连续、集中分析实现高通量、连续、高效且快高效且快速的速的检测过程检测过程, 大大缩减了试验时大大缩减了试验时间间, 减少试剂消耗减少试剂消耗。 并并且且, 基因芯片还具有高灵基因芯片还具有高灵敏性敏性、高准确性、高准确性、载体坚固且耐高温、可对基因表达载体坚固且耐高温、可对基因表达进行进行定定性和定量分析、检测靶分子种性和定量分析、检测靶分子种类等类等特性特性。 此外此外, 芯片制作及对样品的分析、杂交洗片芯片制作及对样品的分析、杂交洗片等过程都等过程都可实可实现自动化现自动化, 工作效率大幅提工作效率大幅提高高

8、1.4 基因芯片的分类基因芯片的分类 基因芯片大体可分为微阵列芯片基因芯片大体可分为微阵列芯片和微流控芯和微流控芯片两片两种。微阵列芯片种。微阵列芯片又包括固相微阵列芯片和液相又包括固相微阵列芯片和液相微微阵阵列两种。列两种。微阵列芯片微阵列芯片微流控芯片微流控芯片固相微阵列芯片固相微阵列芯片液相微阵列芯片液相微阵列芯片cDNA芯片芯片寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片二、基因芯片在海洋微生物中的应用二、基因芯片在海洋微生物中的应用 2.1 在海洋微生物分类与鉴定方面的研在海洋微生物分类与鉴定方面的研究应用究应用 2.2 在遗传多样性分析与基因突变方面在遗传多样性分析与基因突变方面的应用的应用 2.3

9、在在海海洋微生物基洋微生物基因差异性表达上的因差异性表达上的应用前应用前景景 2.4 在海洋微生物活在海洋微生物活性物质筛选方面的性物质筛选方面的应用应用2.1 在海洋微生物分类与鉴定方面的研究应用在海洋微生物分类与鉴定方面的研究应用 分类与鉴定是整个生物学研究的基础。传分类与鉴定是整个生物学研究的基础。传统统的分的分类鉴定方法主要以形态鉴定为主类鉴定方法主要以形态鉴定为主, 需需借助显微借助显微镜对微生物显镜对微生物显微结构进行观察微结构进行观察, 该该方法具有一定局限性方法具有一定局限性。 以一些共生藻类为以一些共生藻类为例例, 因适应共生生活的需因适应共生生活的需要要, 其其细胞细胞形态

10、特征改变或丧失形态特征改变或丧失, 这使得这使得对对这些藻这些藻体的形体的形态学态学鉴定工作变得非常困难鉴定工作变得非常困难 相对相对于形态学性状而言于形态学性状而言, 分子性状不仅是前分子性状不仅是前者的补充者的补充,而而且具有能较客观准确地反映生且具有能较客观准确地反映生物类群之间的系物类群之间的系统发统发生、易于定量化等优生、易于定量化等优点。点。不过分子生物技术不过分子生物技术也存也存在操作复杂、在操作复杂、费用较高、现场检测效率低等问费用较高、现场检测效率低等问题题尤其面尤其面对赤潮灾害对赤潮灾害, 还无法建立快速准确的分子还无法建立快速准确的分子预预警警机制机制。 基基因芯片就可突

11、破这个瓶颈因芯片就可突破这个瓶颈, 能在现场能在现场展开展开实时分类和鉴定。实时分类和鉴定。2.2 在在遗传多样性分析与基因突变方面的应用遗传多样性分析与基因突变方面的应用 海洋微藻数量巨大、种群繁多、多样性程度高。海洋微藻数量巨大、种群繁多、多样性程度高。利用基因芯片来检测遗传多样性利用基因芯片来检测遗传多样性, 突显快速、突显快速、高通量且准确的优势高通量且准确的优势, 尤其是使用芯片实验室尤其是使用芯片实验室(Lab-on-a-Chip)。它将分子杂交、显影等步骤。它将分子杂交、显影等步骤微缩至同一块芯片上进行微缩至同一块芯片上进行, 实现反应流程化、实现反应流程化、衔接快速化衔接快速化

12、, 真正意义上达到自动、智能处理真正意义上达到自动、智能处理分析样品和结果。分析样品和结果。 此外此外, 基基因芯片还可以准确地确定突变位点和因芯片还可以准确地确定突变位点和突变类型突变类型, 同时检测多个基因乃至整个基因组同时检测多个基因乃至整个基因组的突变的突变, 对发现新藻株和经济藻类选育有所帮对发现新藻株和经济藻类选育有所帮助。助。2.3在在海洋微生物基海洋微生物基因差异性表达上的应用前景因差异性表达上的应用前景 基因芯片技术可以直接检测基因芯片技术可以直接检测mRNA的种类及的种类及其丰富度其丰富度, 因而成为研究基因表达的有力工因而成为研究基因表达的有力工具具 。然而。然而, 基因

13、表达受到外界环境和内在环基因表达受到外界环境和内在环境双重影响。在不同的环境条件下境双重影响。在不同的环境条件下, 基因表基因表达的效果存在一定差异。达的效果存在一定差异。 如在有毒赤潮生物产毒机制的研究中如在有毒赤潮生物产毒机制的研究中, 研究研究人员可借助基因芯片便捷直观地分析产毒人员可借助基因芯片便捷直观地分析产毒基因在外界环境及内在生理变化等因素影基因在外界环境及内在生理变化等因素影响下的差异性表达响下的差异性表达,2.4 在海洋微生物活在海洋微生物活性物质筛选方面的应用性物质筛选方面的应用 海洋海洋微生微生物物体体内内含有在代谢过程中产生的大量含有在代谢过程中产生的大量活活性性物质物

14、质, 具有很高的应用价值具有很高的应用价值。 如如蛋白质蛋白质, 许多许多微藻微藻体内的蛋白含量达到体内的蛋白含量达到60%以上以上, 营养价值颇高营养价值颇高,可可作为营养保健食作为营养保健食品品, 螺旋藻等就已螺旋藻等就已在许多在许多国家国家实现产业化生产实现产业化生产;藻胆蛋白藻胆蛋白, 在蓝藻等藻在蓝藻等藻类体类体内含内含有有, 具有荧光特性具有荧光特性, 免疫学上常被制成荧免疫学上常被制成荧光光探针探针; 多多不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸(PUFAs), 包括长链不饱包括长链不饱和脂和脂肪酸肪酸EPA(二十碳五烯酸二十碳五烯酸)和和DHA(二十二碳二十二碳六烯六烯酸酸), 它们它们对婴幼

15、儿大脑发育及成人心血管疾对婴幼儿大脑发育及成人心血管疾病治病治疗和预防疗和预防有一定的效有一定的效果果 , 金藻中的金藻中的PUFAs含量含量几乎占到其脂几乎占到其脂肪酸总量的肪酸总量的1 /2。 对这些活性物质进行筛选对这些活性物质进行筛选, 开发相关产业开发相关产业, 可为可为人类提供更多更广的生活物质。人类提供更多更广的生活物质。 传传统的方法耗时长、效率低统的方法耗时长、效率低, 如运如运用基因工程用基因工程技术转移调控特定物质产生的基技术转移调控特定物质产生的基因至因至细菌中表细菌中表达达, 其中筛选特定基因就需花费大其中筛选特定基因就需花费大量时量时间间。 基基因芯片因其快速、高通

16、量等特点因芯片因其快速、高通量等特点, 有着有着显著显著优势优势, 单从筛选特定基因上看就可节省不少单从筛选特定基因上看就可节省不少时时间间。如。如cDNA芯片便可用于筛选反义寡核苷酸芯片便可用于筛选反义寡核苷酸类药物类药物三、基三、基因芯片在因芯片在海洋微生物研海洋微生物研究中存在的问究中存在的问题题及展及展望望 (1)目前人类对海洋目前人类对海洋微生物的微生物的分子分子生物生物学研究学研究还不够深入和全面还不够深入和全面, 海洋微生物基海洋微生物基因信息少因信息少, 甚甚至不少种至不少种的基因信息为空白的基因信息为空白, 芯片的使用范围芯片的使用范围受受到限制；到限制； (2)部分探针的特异性不部分探针的特异性不高高, 检测结果不尽检测结果不尽人意人意; (3)基因芯片造价昂贵基因芯片造价昂贵, 虽然操作简单方便虽然操作简单方便, 但从但从商业成本上考虑商业成本上考虑, 实用性不如传统技实用性不如传统技术术； (4)芯芯片的片的