动物细胞培养的应用PPT学习教案

1、会计学1动物细胞培养的应用动物细胞培养的应用疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等第1页/共22页微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞PH控

2、制添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液搅拌速度速度快、范围广较慢溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度改变进入气体的氧浓度培养基灭菌方法高温蒸煮过滤培养时间几小时几天几天3、4周对水纯度的要求较低很高与与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长

3、。 第2页/共22页5、动物细胞大规模培养工艺、动物细胞大规模培养工艺 大规模动物细胞培养的工艺流程如图大规模动物细胞培养的工艺流程如图11-15所示。工艺过程中，先将所示。工艺过程中，先将组织切成碎片组织切成碎片，然后，然后用溶解蛋白质的酶处理用溶解蛋白质的酶处理而得到单个细胞，再用而得到单个细胞，再用离心法离心法收集细胞。将收集细胞。将细胞植入营养培养基细胞植入营养培养基，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再接种到若干培养瓶中进行扩大培养接种到若干培养瓶中进行扩大培养，将培养所得的细胞，将培养

4、所得的细胞“种子种子”冷藏于液氮中冷藏于液氮中，从液氮中取出一部分细胞，从液氮中取出一部分细胞“种子种子”进行解冻、复活培养进行解冻、复活培养，进行，进行扩大培养扩大培养以获得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行以获得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行大规模培养大规模培养，按照产物的不同形式进行，按照产物的不同形式进行产物分离纯化产物分离纯化。对于积累在细胞内的产物，可通过收集细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物，可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些。对于积累在细胞内的产物，可通过收集细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对

5、于由细胞分泌到培养液中产物，可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收集细胞，再经分离纯化得到产物。才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收集细胞，再经分离纯化得到产物。第3页/共22页细胞培养反应器细胞培养反应器提取提取细胞细胞诱生剂诱生剂细胞细胞产品（肿瘤抗原）产品（肿瘤抗原）纯化纯化产品（干扰素）产品（干扰素）纯化纯化提取提取产品（单克隆抗体）产品（单克隆抗体）浓缩纯化浓缩纯化79865432110第4页/共22页内容（一）内容（一）单克

6、隆单克隆抗体抗体哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。抗体最早是由德国微生物学家贝林发现的，它们存在于人和脊椎动物的血清之中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以消灭抗原，因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着杂交瘤技术、蛋白质工程和转基因技术等技

7、术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。第5页/共22页抗体抗体由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。抗原抗原指诱导产生抗体的物质。如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴

8、细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。有毒物质或病原物侵入，即抗原侵入抗体2抗体1第6页/共22页于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。多克隆抗体多克隆抗体在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。单克隆抗体单克隆抗体由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。第7页/共22页第8页/共22页细胞系细胞系Fuc Gal唾液酸唾液酸1,6 1 , 3 Fuc1,3GalS O4-GalNAc2,3 2,6糖基糖基化化等分

9、等分GluNAcBHK+0+0+0-0CHO+-00+0+0鼠杂交瘤鼠杂交瘤+0+0+0+ +0C127+0+ +0J558L+0+-+ +0人淋巴细胞人淋巴细胞+000+0+人垂体人垂体+00+0+Namalwa+000+-人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤+000+0第9页/共22页动物细胞制药的表达系统与特征动物细胞制药的表达系统与特征 昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。 一、哺乳动物细胞表达系统与特征一、哺乳动物细胞表达系统与特征1. 动物细胞的特征动

10、物细胞的特征 细胞膜、细胞膜、细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。内容（二）内容（二）第10页/共22页2哺乳动物细胞株系哺乳动物细胞株系CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁型生长，是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白型生长，是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白药物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬，而内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗

11、透压有较高的忍受能力。蛋白质浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。接近天然。有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有脯氨酸。二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、疫苗、G-CSF、凝血因子凝血因子、DNA酶酶，已上，已上市。市。使用氨甲酰喋呤使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。表达水平。第11页/共22页B

12、HK21：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，非整倍幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，非整倍体体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表达表达的重组凝血因子的重组凝血因子已被获准上市。已被获准上市。C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞，贴壁从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞，贴壁型生长。型生长。C127细胞系已表达多种外源基因，其中细胞系已表达多种外源基因，其中EPO的的水平达水平达10 mg/L，生产生产rhGH已被批准上市。已被批准上市。3T3：HIN Swiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量

13、表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：J558LJ558L是小鼠是小鼠BALB/cBALB/c骨髓瘤细胞，分泌骨髓瘤细胞，分泌IgAIgA，用于转染研究。用于转染研究。NSONSO和和SP2/OSP2/OAg14Ag14不分泌不分泌IgIg，与淋巴与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。第12页/共22页杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬分离获得杂交瘤细胞系，能在无血清

14、培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，浮生长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制大量分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。备。VeroVero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用有突变细胞系能用无血清培养。最为常用Vero E6Vero E6增殖多增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬

15、病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。COSCOS：是从是从SV40 DNASV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞转化的非洲绿猴肾细胞CV1CV1中分离得中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。GH3GH3用于生长激素研究，用于生长激素研究，293293细胞系用于基因治疗的研究细胞系用于基因治疗的研究。 第13页/共22页3昆虫细胞株系昆虫细胞株系Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离

16、得到，细胞较大，容易从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。放大，高效表达外源基因。Sf9：从秋粘虫的卵巢细胞（从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最中分离得到，是最常用的昆虫表达细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，常用的昆虫表达细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表达外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基能高效表达外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。的搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的

17、能力比Sf9细胞系细胞系高高20多倍，能适应悬浮培养。多倍，能适应悬浮培养。第14页/共22页三、细胞转染三、细胞转染转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称。基因导入真核细胞的方法很多，主要有化学转染、物。基因导入真核细胞的方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导的转化。理转染和病毒介导的转化。方法方法表 达 类表 达 类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点基因枪基因枪瞬 时 ，瞬 时 ，稳定稳定无无多种细胞组多种细胞组织，器官织，器官有效，仪器有效，仪器操作操作显微注射显微注射瞬 时 ，瞬 时 ，稳定稳定无无多种细胞多种细胞有效，

18、技术有效，技术难度大难度大电穿孔电穿孔瞬 时 ，瞬 时 ，稳定稳定无无多种细胞多种细胞有效，仪器有效，仪器操作操作冲击波冲击波瞬 时 ，瞬 时 ，稳定稳定无无多种细胞，多种细胞，局部组织局部组织简单有效，简单有效，仪器操作仪器操作第15页/共22页方法方法表达类表达类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点逆 转 录 病逆 转 录 病毒毒瞬时，瞬时，稳定稳定无无对 应 的 宿对 应 的 宿主细胞主细胞有效有效原 生 质 体原 生 质 体融合融合瞬时，瞬时，稳定稳定无无悬浮细胞悬浮细胞技术复杂技术复杂生物转染特点生物转染特点第16页/共22页化学转染是最常用的转染方法。化学转染是最常用的转染方法。其

19、基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖（葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。磷酸钙与磷酸钙与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的形成不溶性沉淀，带正电荷的DEAE葡葡聚糖与带负电荷的聚糖与带负电荷的DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹磷酸基团结合，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。形成脂质体。渗透性休克和渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进等化学试剂能促进DNA进入细胞。进入细胞。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂

20、转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。影响因素：细胞培养物的密度、影响因素：细胞培养物的密度、DNA的大小、纯度与用的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。第17页/共22页方法方法表达类表达类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点磷酸钙磷酸钙瞬时、瞬时、稳定稳定无无贴壁细胞，贴壁细胞，悬浮细胞悬浮细胞简单简单DEAE-葡葡聚糖聚糖瞬时瞬时有有CV1，COS简单简单阳 离 子 树阳 离 子 树脂脂瞬时、瞬时、稳定稳定有或有或无无贴壁、原代贴壁、原代悬浮细胞悬浮细胞简 单 ， 有简 单 ， 有效效化学转染的特点化学转染

21、的特点第18页/共22页四、转染体筛选与分离四、转染体筛选与分离转染后转染后16天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因的瞬时表达。交，检测外源基因的瞬时表达。为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培养养2448小时，让细胞倍增小时，让细胞倍增12代，使转染代，使转染DNA表达。表达。再按再按1：15比例转移到选择性培养基上，每比例转移到选择性培养基上，每24天更换天更换培养基，持续培养基，持续23周，促进抗性细胞生长，清除死细胞周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残骸，最后得到独立的克隆。残骸，最后得到独立的克隆。在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因