CML的实验室检测

1、We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyCMLCML的实验室检测概述的实验室检测概述道道培血液培血液 肿瘤中心肿瘤中心 刘红星刘红星2014-09-212014-09-21北京北京We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyCMLCML的病因和治疗的病因和治疗BCR-ABL1 DNABCR-ABL1 mRNA 0.1-1KBCR-ABL1 Protein n*0.1M主要代谢酶：主要代谢酶：CYP3A4抑

2、制：抑制：CYP2C9；CYP2C19TKIs血浆药物浓度血浆药物浓度TKIs持续增殖持续增殖凋亡凋亡抑制抑制We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyCMLCML的主要实验室检测项目的主要实验室检测项目项目项目检测灵敏度检测灵敏度优点优点缺点缺点其它其它血常规血常规初诊时常可目测到初诊时常可目测到白细胞数目的增加白细胞数目的增加费用费用低低特异性差特异性差血细胞形态血细胞形态可反映可反映CP、AP、BC直观直观的骨髓和外周血的骨髓和外周血细胞细胞检查检查非特异，检测灵敏度有限非特异，检测灵敏度有限

3、染色体核型染色体核型10-1可反映附加的染色体可反映附加的染色体异常异常；可反映；可反映AP、BC灵敏度有限，报告周期长，灵敏度有限，报告周期长，有一定的培养失败率有一定的培养失败率FISH10-3特异、可特异、可反映细胞内反映细胞内BCR-ABL1扩增扩增费用较高，检测灵敏度有费用较高，检测灵敏度有限限多用作验证检多用作验证检测测RQ-PCRBCR-ABL1 mRNA10-4.5-10-5.5灵敏度高，特异性好，灵敏度高，特异性好，报告快报告快对质控要求严格；定量值对质控要求严格；定量值不直接反映细胞数的比例不直接反映细胞数的比例TKIs耐药突变耐药突变15-20%；2-5%检测主要的耐药检

4、测主要的耐药原因；原因；指导换药指导换药耐药耐药因素之一因素之一TKIs血药浓度血药浓度10ng/ml-辅助个体化用辅助个体化用药药CYP3A4基因遗传多样性基因遗传多样性综合的影响因素综合的影响因素辅助个体化用辅助个体化用药药CP:慢性期；慢性期；AP:加速期；加速期；BC:急变期；急变期；FISH:荧光原位杂交荧光原位杂交RQ-PCRRQ-PCR定量检测定量检测BCR-ABL1 mRNABCR-ABL1 mRNAWe Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology为什么为什么RQ-PCRRQ-PCR检测灵

5、敏度检测灵敏度更更高？高？BCR-ABL1 mRNAABL1 mRNA各约各约n*1KBCR-ABL1 DNA常规取2-5106细胞起始约2-5108-9个目标分子混匀在一起供下游检测裂解细胞抽提mRNA染色体核型：染色体核型：需要对每个细胞的所有染色体进行人工分析，常规分析20个细胞的核型RQ-PCRFISH：需要人工每个细胞的杂交信号，常规浏览数千个细胞，分析300-500个细胞。转化为荧光信号进行定量和比例分析We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyRQ-PCRRQ-PCR的影响因素的影响因

6、素细胞裂解提取RNA有核细胞悬液制备反转录（R）Q-PCR和定量信号分析起始标本量；起始标本量；疾病状况；疾病状况；标本保存、运输；标本保存、运输；制备制备的的细胞质量细胞质量RNA提取效率，提取效率，完整程度（不完整程度（不易保证和评估）易保证和评估）反转录效率反转录效率（不易评估）（不易评估）RNA极易降解，对操作人员和实验室质控要求高极易降解，对操作人员和实验室质控要求高目的基因和内参基目的基因和内参基因的扩增效率差异；因的扩增效率差异；分析参数的设置；分析参数的设置；标准品拷贝数的准标准品拷贝数的准确性确性反转录酶、扩增酶、引物、探针等各种生化试剂的质控保证，每一环节出错都可导致假阴性

7、反转录酶、扩增酶、引物、探针等各种生化试剂的质控保证，每一环节出错都可导致假阴性PCR的独特特点：对目标分子扩增百万倍，容易造成小分子的扩增产物污染，导致假阳性的独特特点：对目标分子扩增百万倍，容易造成小分子的扩增产物污染，导致假阳性We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyRQ-PCRRQ-PCR的影响因素的影响因素定量结果不直接反映肿瘤细胞定量结果不直接反映肿瘤细胞比例：比例：l 细胞结构被破碎，单个细胞的目的基因和内参基因表达的细胞结构被破碎，单个细胞的目的基因和内参基因表达的mRNA分子数存

8、在变数。分子数存在变数。l 定量过程中的指数换算，导致内参基因和目的基因扩增效率的微小差异会对结果有显著定量过程中的指数换算，导致内参基因和目的基因扩增效率的微小差异会对结果有显著影响。影响。l 标本处理和反转录步骤主要影响检测灵敏度；定量值准确性主要受标本处理和反转录步骤主要影响检测灵敏度；定量值准确性主要受Q-PCR时扩增效率的差异影响。时扩增效率的差异影响。虽然影响因素复杂多样，但如果熟知各环节的影响因素，做好质控，需要虽然影响因素复杂多样，但如果熟知各环节的影响因素，做好质控，需要时有能力根据标本情况调整实验细节，生物实验仍可有非常好的重复性。时有能力根据标本情况调整实验细节，生物实验

9、仍可有非常好的重复性。Konstantin B. Ignatov, et al. BioTechniques 2014:57:81-87Minami F. Yamada, et al. /10.1620/tjem.214.97We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyRQ-PCRRQ-PCR定定量值的国际标准化（量值的国际标准化（ISIS）主要是为了不同实验室间的检测结果可主要是为了不同实验室间的检测结果可比比l CF:CF:各实验室的转换系数；各实验室的转换系数；IS:IS:国

10、际标准化国际标准化值值l 主要是报告检测值的可比性，和检测灵敏度主要是报告检测值的可比性，和检测灵敏度无关无关l 尤其各实验室间检测方案不同时尤其各实验室间检测方案不同时需要需要前提是各实验室各自的检测结果稳定、重复性前提是各实验室各自的检测结果稳定、重复性好好目前国内绝大多数实验室都采用目前国内绝大多数实验室都采用EAC-2003EAC-2003方案方案l 理论上采用同一定量方案的实验室间应该具有比较天然的可比理论上采用同一定量方案的实验室间应该具有比较天然的可比性性Europe Against Cancer ProgramLeukemia (2003) 17, 23182357Richar

11、d D. Press, et al. J Mol Diagn 2013, 15: 565-76Minami F. Yamada, et al. /10.1620/tjem.214.97We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology标本送检：骨髓还是外周血？标本送检：骨髓还是外周血？S Branford, et al. Leukemia (2006) 20, 19251930Adelaide 实验室进行的一项实验室进行的一项24例例CML患者的患者的PB/BM对照检测：对照检测：3例患

12、者检测结果有持续的差异；例患者检测结果有持续的差异；其它其它11例患者有至少例患者有至少1次出现检测值差异。认为由于取材方便，次出现检测值差异。认为由于取材方便，PB仍可作为常规检测的标本。仍可作为常规检测的标本。We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyBCR-ABL1BCR-ABL1定量报告定量报告OHare T, et al. Nat Rev Cancer. 2012;12(8):513-26. 反映本次检测的灵敏度反映本次检测的灵敏度ABL1内参内参数数31250We Prompt the

13、Applications & Innovations of Laboratory HematologyBCR-ABL1BCR-ABL1定量值定量值: :降的越快越安全降的越快越安全肿瘤发生、发展的一般肿瘤发生、发展的一般规律，治疗规律，治疗反应反应快快的患者的患者：l 可能可能除除BCR-ABL1外的其它伴随突变相对外的其它伴随突变相对较少、基因组较少、基因组不稳定因素较少。不稳定因素较少。l 残存残存的肿瘤细胞少，出现继发突变的概率减低。的肿瘤细胞少，出现继发突变的概率减低。Baccarani M, Soverini S. Blood. 2014;124(4):469-71TKIsT

14、KIs耐药突变耐药突变We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyTKIsTKIs耐药突变和检测方法学耐药突变和检测方法学Cowan-Jacob et al. Mini Rev Med Chem 2004;4:285-99l大多数用大多数用基因测序法，激酶区全长的突变均可分析基因测序法，激酶区全长的突变均可分析适用于目前所有的适用于目前所有的ABL1-TKIsl特异性检测特异性检测BCR-ABL1的激酶区：有融合基因即可测序的激酶区：有融合基因即可测序BCR-ABL1定量为定量为阴性时，也有可能可完成

15、检测阴性时，也有可能可完成检测l基因突变的检测灵敏度基因突变的检测灵敏度（占所有（占所有BCR-ABL1的比例的比例）1代测序的突变检测灵敏度约代测序的突变检测灵敏度约15%2代测序可达代测序可达2-5%；更高度灵敏度意义不大；更高度灵敏度意义不大We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology耐耐药突变产生的内在原因药突变产生的内在原因CMLCML肿瘤干细胞的基因组不稳定性是肿瘤干细胞的基因组不稳定性是TKITKI耐药突变、耐药突变、IKZF1IKZF1缺失、缺失、TP53TP53突变的内在原因。突变的

16、内在原因。ImatinibImatinib可以抑制可以抑制BCR-ABL1BCR-ABL1，但并不能抑制，但并不能抑制CMLCML肿瘤干细胞中的氧自由基和肿瘤干细胞中的氧自由基和DNADNA的氧化损伤。的氧化损伤。激酶活性1mM imatinib28h后氧自由基DNA氧化损伤Elisabeth Bolton-Gillespie, et al. Blood. 2013;121(20):4175-83*P.01 in comparison with untreated normal cells, *P .05 in comparison with untreated CML-CP cellsand

17、 normal cells, and *P 1000ng/ml1000ng/ml是是较为理想的浓度。较为理想的浓度。We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology本实验室ALL患者Imatinib（格列卫）血浆浓度检测结果01000200030004000500060007000200mg/d300mg/d400mg/dN= 8 7 10Imatinib 血浆谷浓度 (ng/ml)We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hem

18、atologyImatinibImatinib血药浓度检测血药浓度检测治疗反应不理想，怀疑血药浓度不理想时治疗反应不理想，怀疑血药浓度不理想时有较显著、甚至严重的副作用时有较显著、甚至严重的副作用时怀疑服药依从性时怀疑服药依从性时有其它合并用药的影响时有其它合并用药的影响时更换不同厂家药物，担心药物吸收等有差异时更换不同厂家药物，担心药物吸收等有差异时测血浆谷浓度，即下次服药前采集外周血标本。测血浆谷浓度，即下次服药前采集外周血标本。稳定剂量服药稳定剂量服药1 1周后检测周后检测We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology遗传多态性影响遗传多态性影响TKIsTKIs疗效？疗效？We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyAnnette S. Gillings, et al. F