CRISPRCas9基因组编辑技术、

1、CRISPR/Cas9基因组编辑技术与基因组编辑技术与植物基因功能研究植物基因功能研究尹翠翠、田正书、李德富、高虎虎尹翠翠、田正书、李德富、高虎虎CRISPR/Cas9clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶9系统1987 年，Ishino 等研究大肠杆菌 iap 基因的序列和功能时发现，在该基因的 3 端非翻译区存在 5 个 高度保守的长为 29 nt 的重复序列，这些重复序列被长度为 32 nt 的非重复序列间隔开2007 年，Barrango

2、u 等3首次利用实验证明了嗜热链球菌的 CRISPR 系统直接参与细菌对噬菌体的适应性免疫反应2012 年，Jinek 等对细菌的 II 型 CRISPR 系统进行改造和优化，成功地在体外定点切割了环状质粒 DNA 和线性寡聚核苷酸片段CISP-Cas 系统与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关细菌和古细菌破坏噬菌体和外源质粒的免疫保护CISP-Cas 系统可识别并降解外源入侵的 DNA 序列CRISPR/Cas9CISP 基因簇由 CISP 序列与 Cas 蛋白的编码基因组成CISP 序列为一系列由不同的间隔序列( spacers) 间隔的同向重复序列间隔序列来源于外源基因片段即原间隔序列

3、Cas 蛋白的编码基因将表达为核酸酶、解旋酶与聚合酶等；CISP 序列则转录加工为短的 CISP NAs( crNAs) ，指导 Cas 蛋白与外源入侵片段的识别与降 解。CISP-Cas 系统介导的基因组编辑技术的基本原理，通常将 crNA 与 tracrNA 序列融合为一条引导 NA 序列( single gNA，sgNA)CISP-Cas9基因组编辑技术NA介导的靶向内切酶 CISP-Cas9 基因组编辑技术通过一段短的引导 NA( guideNA) 来引导CAS 9蛋白识别特定的 DNA 序列基因组编辑技术4 种用于基因组编辑的的人工核酸内切酶种用于基因组编辑的的人工核酸内切酶巨核酶技

4、术( Meganucleases锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)(Urnov等2010)转录因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)基因组基因组编辑技术编辑技术成本较高，操作较为繁琐，脱靶风险较高。规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CAS9) (Mali等2013)ADVANTAGE利用多个引导 NA 序

5、列可同时进行基因组上多个不同位点的编辑; 将其DNA 结合域与不同转录调控蛋白相融合，可实现对特定基因的转录激活或抑制; 将对特定序列的调控蛋白模块与基因组或表观基因组的修饰酶相融合，则可实现对基因组的动态控制Application of CRISPR/CasTechnology引导 gNA 的选择靶 DNA 序列的设计Cas9 与 gNA 的表达与定位提高打靶特异性的策略降低 sgNA 与Cas9 的浓度，但这一方法的效果还有待讨论。有研究表明该方法可显著降低脱靶突变/打靶突变的比例，但也有研究称该方法将同时降低脱靶突变与打靶突变的发生。利用 Cas9 的切口酶突变体( D10A 突变体或 H840A 突变体) 产生 DNA 单链断裂。sgNA 的截短与修饰，如截短其 3端相当于 tracrNA 的序列、在其 5端增加两个额外的 GG 以及在截短互补识别序列中 5端的2 个或 3 个碱基均可提高 Cas9 的特异性。目前，C