微工第2章培养基制备与灭菌

1、第二章 培养基的制备与灭菌2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌1纯种培养的基础影响生长、代谢、产物合成与纯化1、培养基的组成？如何选择培养基？ 2、如何制备培养基？ 3、如何对培养基进行灭菌？2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌2第一节 培养基的原材料一、培养基的营养成分及用途 光 光能自养 自养菌 氢、硫、氨 化能自养 1.能源 亚硝酸盐、亚铁盐 碳水化合物等有机物 石油天然气和石油化工产品（如醋酸） 异养菌 功能：生长、繁殖需要；2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌3 碳酸气 2.碳源 淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡、天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化

2、工产品 功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌4 有机氮：黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、蛋白胨、 3.氮源 酵母粉、鱼粉、发酵菌丝体、酒糟水等 无机氮： 尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐 功能：构成菌体、含氮代谢物；2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌5 磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐 4.无机盐 铁、锰、钴等微量元素 功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节pH值，维持氧化还原电位；2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌65.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等 功能：酶的辅助部分，维持生命活动；2022-5-1

3、9第二章 培养基制备与灭菌76发酵的促进剂与抑制剂发酵培养基中某些成分的加入有利于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些物质包括前体、促进剂和抑制剂2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌81）、前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 如：在青霉素生产中加入玉米浆，青霉素产量可从20u/mL增加到100u/mL，研究发现玉米浆中的苯乙胺被有限结合到青霉素分子中，从而提高了青霉素G的产量。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌92）、促进剂：指那些既不是营养物又不是

4、前体，但却能提高产量的添加剂。比如在酶制剂发酵过程中，加入诱导物、表明活性剂及其它一些产酶促进剂（比如吐温80、植酸、洗衣粉等）2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌103）、抑制剂：在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。 例如：微生物发酵生产甘油中，例如亚硫酸氢钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌117.水分功能：生化反应均在水溶液中进行2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌12二、培养基的类型1.依营养物质的来源分类天然培养基；天然培养

5、基；合成培养基，合成培养基，也称组合培养基（多用于定量研究）；半合成培养基，（半合成培养基，（用的最多，在部分天然有机碳源、氮源、生长因子的基础上，适当加入一些化学药品）；2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌132.依培养基的物理状态来分：1）固体培养基A、凝固培养基 ：即遇热可融化，冷却后则凝固的固体培养基B、非可逆性凝固培养基：指有血清凝固成的固体培养基或由无机硅胶配成的凝固后即不能再融化的固体培养基C、天然固体培养基：由天然固体状基质直接制成的培养基，如麸皮，米糠，木屑等D、滤膜：是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜，把它制成圆片状覆盖再营养琼脂或浸有培养液的纤维衬垫上，就形成了

6、具有固体培养基性质的培养条件。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌142）半固体培养基 配置好的液体培养基中加入0.5%左右的琼脂作为凝固剂，形成的培养基称之微半固体培养基。 主要用于菌种鉴定，观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌153）液体培养基；培养基中8090%是水。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌163.依培养基的用途来分1）、孢子培养基2）、种子培养基3) 、 发酵培养基4）、补料培养基5）、加富培养基6）、选择培养基7）、鉴别培养基8）、增殖和保存培养基9）、富集培养基10）、测定培养基2022-5-19第二章 培养基制备与

7、灭菌17三、发酵培养基的选择一）、配置培养基的原则1、根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基2、注意各营养物质的浓度和配比3、调节适宜的物理化学条件4、根据培养微生物的目的配置5、尽量使用廉价易得的原料2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌181、生态模拟2、查阅文献3、借助优选法或正交试验法精心设计培养基配方4、实验比较实验的规模一般由定性到定量，由小到大。发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；（举例1 ，2，3）二）、配置培养基的方法2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌19培养基配方举例牛肉膏蛋白胨培养基(常用的细菌培养基) 牛肉膏5

8、克 蛋白胨10克 NaCl5克 水1000毫升 pH7.27.4 (琼脂1520克)高氏一号培养基(常用的放线菌培养基) 可溶性淀粉20克 KNO31克 K2HPO40.5克 MgSO40.5克 NaCl 0.5克 FeSO40.01克水1000毫升琼脂1520克pH7.47.62022-5-19第二章 培养基制备与灭菌20察氏培养基(培养霉菌用) 蔗糖 20克 NaNO33克 K2HPO41克 KCl1克 MgSO40.5克 FeSO40.01克 琼脂20克 水1000毫升自然pH无氮培养基(培养自生固氮菌用) 葡萄糖 10克 NaCl0.2克 KH2PO40.2克 CaSO42H2O0.1

9、克 MgSO40.2克 CaCO35克 琼脂 20克水1000毫升自然pH伊红-美蓝培养基(检查肠道细菌用) 蛋白胨 10克 K2HPO42克乳糖10克琼脂25克，水1000毫升，pH7.6 2伊红水溶液2毫升0.5美蓝水溶液2毫升将乳糖、伊红、美蓝分别灭菌后，加入灭菌的培养基中摇匀，倒平板。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌21四、原料转换及意义1、节约原料，减低单耗，提高发酵单位和总收率；2、开拓新的原料资源和微生物资源：野生植物淀粉、植物纤维、木屑水解物、石蜡、醋酸、乙醇2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌22第二节 淀粉水解糖的制备一、淀粉水解糖的制备方法1、酸解法：定义

10、：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法.优点：设备要求简单，水解时间短（20min），设备生产能力大缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌232、酶解法：（双酶水解法） 定义：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。一般分为两步：第一步是利用淀粉酶将淀粉液化转为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，称为糖化。也称双酶法2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌24-淀粉酶

11、（液化）葡萄糖淀粉酶（糖化）优点：1、反应条件温和。 2、酶的专一性强，副反应少 3、可在较高的淀粉乳浓度下水解 4、糖液的营养物质丰富 5、糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液的精制缺点：时间长（23）天，要求的设备多，糖液过滤困难。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌253、酸酶结合法酸酶法酶酸法2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌26二、淀粉酸水解理论基础淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生这：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。复合反应：葡萄糖分子间经1-6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。分解反应：葡萄糖 羟甲基糠醛 有机酸

12、、色素等2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌27淀粉的水解反应1.淀粉水解过程颜色变化：蓝色 暗紫 紫 红褐 暗红 红 浅红糖苷键断裂形成共轭酸进攻糖苷键的OOHH3 2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌282、淀粉酸水解反应动力学属于单分子一级反应类型：K：反应速度常数，由反应条件（如温度、酸度等）而定C：淀粉浓度dck cdt2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌293、影响酸水解的因素 酸的种类主要因素 浓度（酸的浓度、淀粉的浓度） 水解温度2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌30（二）、葡萄糖的复合反应及其影响因素复合反应：在淀粉的酸糖化过程中，水解生成的葡萄糖受

13、酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌31影响复合反应的因素：1、淀粉浓度的影响（用DE值表示葡萄糖纯度）：DE值还原糖/干物质1002.、酸的影响：2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌32（三）葡萄糖的分解反应及其影响因素葡萄糖 5-羟甲基糠醛 乙酰丙酸、蚁酸、有色素物质；影响因素：浓度、温度、pH值； 酸、热2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌33第三节 糖蜜前处理一、糖蜜的来源与特点二、糖蜜前处理的方法1、加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）：糖蜜加水稀释到500Bx 加入0.20.3浓硫酸，通入压缩空

14、气1h 静置澄清8h，取上清液。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌342、加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法）： 糖蜜加水稀释到40 加适量硫酸调节pH值到44.5 放入澄清槽加热至8090，通风30min 保温 7080 812 小时，取上清液。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌353、添加絮凝剂澄清处理法：糖蜜稀释至3040 Bx 加硫酸调pH 33.8 加热至90 添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），搅拌均匀 静置1小时，取上清液。2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌36三、谷氨酸发酵糖蜜前处理1.糖蜜预处理法活性炭处理法树脂处理法亚硝酸处理法2.添加化学药剂处理法添加青

15、霉素法添加表面活性剂添加抗氧剂法2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌373.追加糖蜜法4. 营养缺陷型变异株法第四节 其他原料的处理一、纤维素及发酵废液的处理（一）、利用纤维素废料生产SCP稻草、麦秆、玉米的茎和叶、甘蔗渣、废纸等流程如下：2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌38纤维原料 粉碎 水解 中和 澄清 过滤 发酵罐培养 分离 废液 种子 营养盐 菌体 浓缩 磨碎 干燥 成品 2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌39（二）利用柠檬酸中和滤液生产酵母酵母菌种斜面一级种子二级种子离心分离中和废液盐酸调pH3.5发酵干燥粉碎包装二次废液用于发酵培养基的配置等2022-5-1

16、9第二章 培养基制备与灭菌40二、亚硫酸盐废液的处理（一）亚硫酸盐制浆废液生产酒精和蛋白质1、亚硫酸盐纸浆废液生产酒精2、亚硫酸盐纸浆废液发酵生产蛋白质3、亚硫酸铵法非木材制浆废液培养SCP （二）亚硫酸盐废液发酵生产乳酸三、木屑水解液发酵生产衣康酸2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌41 第五节 培养基灭菌一、消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒：指用物理和化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消灭杂菌和防止杂菌污染2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌42二

17、、灭菌方法：干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）；1、干热灭菌法 灼烧灭菌、在电热或红外线在设备内加热 主要用于保持干燥的物料、器具等2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌43 2、湿热灭菌法 借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。优点： 1)蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒 2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底 3)蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌 4)蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易缺点： 1)设备费用高 2)不能用于怕受潮的物料灭菌20

18、22-5-19第二章 培养基制备与灭菌443、射线灭菌 紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和Y射线化学药品灭菌法（1）第一大类：表面消毒剂高锰酸钾溶液：0.10.25%、漂白粉 、75的酒精、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛 37、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚类2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌45（2）第二大类：抗代谢药物 化学结构与微生物必须的代谢物类似 例如：磺胺类化合物取代氨基苯甲酸（3）第三大类：抗生素 2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌46三、加热灭菌的原理1.、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力； 致死温度、致死时间2、微生物的热致死动力学：对数残留定律2022-5-

19、19第二章 培养基制备与灭菌47一级反应： 用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡率），与N呈线性关系，即：式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比热致死速率常数，单位是min-1 ，其值与菌的种类和加热温度有关，需通过实验才能测定。NKddN2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌480000lnNKNdNNKdKNNeNN 积分边界条件：N0N；t0=0式中， 灭菌时间（s）；N0 灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个）；N 经过灭菌时间后，残存的活菌数（个）。 0001lnlnlnNNNKKNNKN 2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌493、热致死反应的速度常数K K是表

20、达微生物耐热性的特征常数 ，与微生物的种类和灭菌温度有关。K越小，微生物越耐热2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌502022-5-19第二章 培养基制备与灭菌512022-5-19第二章 培养基制备与灭菌524、灭菌温度的选择式中 E为菌体死灭反应的活化能（J/mol），它是菌体死灭反应的特征常数，所以，不同菌其热死灭反应的E不同。 TREeAK2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌532022-5-19第二章 培养基制备与灭菌54四、影响培养基灭菌的其他因素培养基成分、pH值、培养基中的颗粒、泡沫2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌55五、分批灭菌与连续灭菌一）、分批灭菌的操作过程（实罐灭菌）1）培养基的预热培养基先加热到8090，然后再导入蒸汽升温到120180。目的：1）防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释 2）防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。方法：先将排气阀打开2022-5-19第二章 培养基制备与灭菌562）培养基灭菌 从各路通