高效液相色谱法(2010)

1、1第十二章第十二章 高效液相色谱法高效液相色谱法 经典液相色谱法为基础，经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术，引入气相色谱法的理论和实验技术，高压输送流动相，高压输送流动相，高效固定相及高灵敏度检测器，高效固定相及高灵敏度检测器，现代液相色谱分析方法。现代液相色谱分析方法。 2 颗粒极细（一般为颗粒极细（一般为10 m以下）、规则均匀的以下）、规则均匀的固定相，固定相，(键合相键合相)传质阻抗小，柱效高，分离传质阻抗小，柱效高，分离效率高；效率高； 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测高灵

2、敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达器最小检测限可达10 9g，而荧光检测器最小检，而荧光检测器最小检测限可达测限可达10 12g。 3第第1 1节节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪4HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检测器的正常响应。测器的正常响应。 一、输液系统一、输液系统（一）溶剂脱气与过滤（一）溶剂脱气与过滤 抽真空脱气抽真空脱气 超声波振荡脱气超声波振荡脱气 吹氦脱气吹氦脱气 溶剂应经过溶剂应经过0.45m滤膜过滤，以除去溶剂中的固滤膜过滤，以除去溶剂

3、中的固体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵 5（二）高压输液泵（二）高压输液泵对输液泵的基本要求：对输液泵的基本要求：流量准确可调。流量准确可调。流动相的流速在流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常，流量控制精度通常要求小于要求小于0.5%。 耐高压。耐高压。通常要求泵的输出压力达到通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。的高压。液流稳定。液流稳定。输出的液流应无脉动输出的液流应无脉动泵的死体积小。泵的死体积小。泵的死体积通常要求小于泵的死体积通常要求小于0.5mL。 密封性能好，耐腐蚀密封性能好，耐腐蚀6输液泵按输出

4、液恒定的因素分恒压泵和恒流泵，恒输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵，恒流泵的应用更广泛。流泵的应用更广泛。7（三）梯度洗脱装置（三）梯度洗脱装置等度洗脱：等度洗脱：用恒定配比的溶剂系统洗脱，方法用恒定配比的溶剂系统洗脱，方法简便、色谱柱易再生等是其优点。简便、色谱柱易再生等是其优点。梯度洗脱：梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定程序不在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的配比，逐步提高洗脱强度。梯度洗断改变流动相的配比，逐步提高洗脱强度。梯度洗脱可以使一个复杂样品中性质差异较大的组分，都脱可以使一个复杂样品中性质差异较大的组分，都能在各自适宜的分离条件下分离。能在各自适宜的分离条件下

5、分离。梯度洗脱的特点：梯度洗脱的特点：缩短分析周期；缩短分析周期；提高分提高分离效果；离效果；改善峰形，很少拖尾；改善峰形，很少拖尾；增加检测灵敏增加检测灵敏度。度。基线漂移及重复性不佳基线漂移及重复性不佳 8等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱（弱）（弱）（强）（强）AB（弱（弱强）强）9高压梯度（外梯度）高压梯度（外梯度）: 利用两台高压输液泵，将利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱混合后进入色谱柱低压梯度（内梯度）低压梯度（内梯度）: 一台高压泵一台高压泵, 通过比例调通过比例调节阀节阀,将两种

6、或多种不同极性的溶剂按一定的比将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。例抽入高压泵中混合。10二、进样系统二、进样系统进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，结构如图所示：的六通阀进样装置，结构如图所示：11三、分离系统三、分离系统使用色谱柱注意事项：使用色谱柱注意事项：1 溶剂和样品应过滤，溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。防止堵塞。2 加前置柱。加前置柱。3 用完后要清洗用完后要清洗 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管色谱柱是液相色谱的心脏

7、部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。一般色谱柱长得较多。一般色谱柱长530cm，内径为，内径为45mm，12四、检测系统四、检测系统要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、重复性好、适用范围广等。重复性好、适用范围广等。 （一）紫外检测器（一）紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。13紫外检测器包括固定波长、可变波长和光电二极紫外检测

8、器包括固定波长、可变波长和光电二极管阵列检测器管阵列检测器141024个二极管阵列个二极管阵列10ms完成一次检测，完成一次检测，1s采集采集100000个含吸光度、波长、时间的数据，得到一个含吸光度、波长、时间的数据，得到一张吸光度、波长、保留时间的三维色谱图。张吸光度、波长、保留时间的三维色谱图。15 灵敏度高；灵敏度高； 线性范围宽；线性范围宽； 流通池可做得很小流通池可做得很小(1mm 10mm ，容积，容积 8L)； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 特点：特点：（二）荧光检测

9、器（二）荧光检测器 高灵敏度，高选择性。对多环芳烃，维生高灵敏度，高选择性。对多环芳烃，维生素素B B，黄曲霉素，卟啉类化合物，农药，药物，黄曲霉素，卟啉类化合物，农药，药物，氨基酸，甾类化合物等有响应。，氨基酸，甾类化合物等有响应。1617（三）示差折光检测器（三）示差折光检测器 通用型检测器，通用型检测器，但灵敏度低，但灵敏度低，对温度敏感，对温度敏感，不能用于梯度不能用于梯度洗脱洗脱 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。折光指数差值。差值与浓度成正比。18（四）蒸发光散射检测器（四）蒸发光散射检测器 这种检测器可用于

10、挥发性低于流动相的任何样这种检测器可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，但对于有紫外吸收的组分的检测灵品组分的检测，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂敏度较低，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体等几十类化合物。肪酸及甾体等几十类化合物。 在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为 I = k mI = k mb b式中，式中，m m为微粒质量，为微粒质量，k k、b b为实验条件（如温度、流为实验条件（如温度、

11、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。样品进行定量分析。1920五、数据记录处理和计算机控制系统五、数据记录处理和计算机控制系统数据处理系统又称色谱工作站：它可对分析全过数据处理系统又称色谱工作站：它可对分析全过程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。显示，自动采集、处理和储存分析数据。21第第2 2节节 基本理论基本理论高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同，高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同，速率理论略有差异。速率理论略有差异

12、。 一、柱内展宽一、柱内展宽uCCCuBAHssmm)(/1.涡流扩散项涡流扩散项 涡流扩散项与气相色谱法相同，涡流扩散项与气相色谱法相同， A2dp 高效液相色谱多使用高效液相色谱多使用310um球形固定相颗粒球形固定相颗粒 ,以均浆高压装填，以均浆高压装填，A较小。较小。222.分子扩散项分子扩散项 uD2uBm3.流动相传质阻力项流动相传质阻力项 流动相传质阻力，实际包括两方面，一是移流动相传质阻力，实际包括两方面，一是移动流动相传质阻力动流动相传质阻力Hm，二是滞流（静态）流动，二是滞流（静态）流动相传质阻力相传质阻力Hsm。 组分在液体中的扩散系数仅为气体的万分之一组分在液体中的扩散

13、系数仅为气体的万分之一，在高效液相色谱中，在高效液相色谱中,B/u很小，可忽略不计。很小，可忽略不计。2324a.移动流动相传质阻力（移动流动相传质阻力（Cmu） 当流动相在色谱柱内流动时，离固定相较远的组分当流动相在色谱柱内流动时，离固定相较远的组分流动较快，处于固定相颗粒表面的组分流动较慢，流动较快，处于固定相颗粒表面的组分流动较慢，由于这种差别，会使组分的色谱峰扩展由于这种差别，会使组分的色谱峰扩展. 展宽大小与展宽大小与固定相颗粒直径平方成正比，与流动相线速度成正固定相颗粒直径平方成正比，与流动相线速度成正比，与组分在流动相中的扩散系数比，与组分在流动相中的扩散系数Dm成反比：成反比：

14、 uDdCuCm2pmmb.滞流流动相传质阻力（滞流流动相传质阻力（Csmu） 2526 流动相在色谱柱中流动时，有部分流动相进入流动相在色谱柱中流动时，有部分流动相进入到多孔的固定相深孔中，滞留后难以流动。组分分到多孔的固定相深孔中，滞留后难以流动。组分分子进入滞留区造成色谱峰扩展，使柱效降低，子进入滞留区造成色谱峰扩展，使柱效降低，uDdCuCm2psmsm4.固定相传质阻力项固定相传质阻力项 （Csu） 组分分子在固定液中传质时，因所受到的阻组分分子在固定液中传质时，因所受到的阻力不同而引起色谱峰扩展力不同而引起色谱峰扩展uDdCuCS2fSS 在键合相色谱法中，在键合相色谱法中，d d

15、f f很小（单分子层），固定很小（单分子层），固定相传质阻力可以忽略。相传质阻力可以忽略。 27在高效液相色谱中，范第姆特方程可写成：在高效液相色谱中，范第姆特方程可写成： HA + CuA+Cmu+Csmu 随着随着u的增大，的增大，H增增 大，柱效降低，故其最佳流大，柱效降低，故其最佳流速就在速就在u很小的地方。很小的地方。28为了减小柱内展宽，提高柱效，可采取以下措施：为了减小柱内展宽，提高柱效，可采取以下措施： (1)用小而均匀的球形固定相，填充均匀，以减少用小而均匀的球形固定相，填充均匀，以减少涡流扩散。涡流扩散。 （2）使用低粘度的小分子溶剂作流动相，减小流）使用低粘度的小分子溶剂

16、作流动相，减小流 动相传质阻力；动相传质阻力；(3)流动相的流速低，一般控制在流动相的流速低，一般控制在1mL/min左右左右二、柱外展宽二、柱外展宽（4）柱温）柱温25左右为宜。左右为宜。柱温太高，虽柱温太高，虽D Dmm增大，传质阻力减小，但增大，传质阻力减小，但易产易产生气泡，太低不仅减小生气泡，太低不仅减小D Dmm，使传质阻力增大，使传质阻力增大，而且流动相的粘度增大，柱阻加大。而且流动相的粘度增大，柱阻加大。 29采用采用 小体积检测器，小体积检测器，管道对接宜呈流线形，管道对接宜呈流线形，减少减少柱外死体积，从而减小柱外展宽，提高柱效。柱外死体积，从而减小柱外展宽，提高柱效。30

17、 HPLC 高效液相 LSC 液固LLC液液IEC离子交换SEC空间排阻AC亲和色谱IC离子色谱BPC化学键合相NPBPC正相RPBPC反相PIC离子对ISC离子抑制第第3节节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法31一、吸附色谱法一、吸附色谱法 固定相固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是较常使用的是510m的硅胶吸附剂的硅胶吸附剂. 有时也用有时也用（吸附（吸附+分配并兼有小孔凝胶分配并兼有小孔凝胶作用）作用） 以固体吸附剂为固定相，基于其对不同组分吸以固体吸附剂为固定相，基于其对不同组分吸附能力的差异进行混合物的分离。附能力的差异进行混合物的分离。

18、 流动相流动相：常用混合溶剂，主体溶剂为正己烷或常用混合溶剂，主体溶剂为正己烷或环己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或环己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或丙酮等作为调节剂，用于调整流动相的极性。丙酮等作为调节剂，用于调整流动相的极性。32a.表面多孔型表面多孔型 b.无定形全多孔无定形全多孔 c.球形全多孔球形全多孔 d.堆积全多孔堆积全多孔 应用：应用：主要用于分离能溶于有机溶剂的极性与弱主要用于分离能溶于有机溶剂的极性与弱极性混合物及异构体的分离。极性混合物及异构体的分离。二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合以化学键合相为固定相的色谱法称为

19、化学键合相色谱法，简称键合相色谱法。相色谱法，简称键合相色谱法。强极性组分后出峰，弱极性组分先出峰强极性组分后出峰，弱极性组分先出峰 33（一）化学键合固定相（一）化学键合固定相用化学反应的方法将有机分子键合在载体表面上，用化学反应的方法将有机分子键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合固定相，简称键合相。所形成的填料称为化学键合固定相，简称键合相。化学键合相已广泛用于正相与反相色谱法、离子对化学键合相已广泛用于正相与反相色谱法、离子对色谱法等诸多色谱法中。色谱法等诸多色谱法中。1、键合反应、键合反应化学键合相的载体是硅胶，表面有化学键合相的载体是硅胶，表面有SiOH，能与能与合适的有机化合

20、物反应，使具有不同极性功能团的合适的有机化合物反应，使具有不同极性功能团的有机分子键合在表面而获得不同性能的化学键合相，有机分子键合在表面而获得不同性能的化学键合相，它的制备方法主要是用有机氯硅烷与硅醇基发生反它的制备方法主要是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应（硅烷化应（硅烷化 ），生成），生成Si-O-Si-C键合相。键合相。 34由于空间位阻效应，不可能将较大的有机官能团由于空间位阻效应，不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反应。键合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反应。 残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，它可以减小键合相表面的

21、疏水性，对极性溶质产它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化，降低生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化，降低了键合相填料的稳定性，使组分的峰形拖尾。为了键合相填料的稳定性，使组分的峰形拖尾。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用小分子三甲基氯硅烷等进行钝化处理，称封尾。小分子三甲基氯硅烷等进行钝化处理，称封尾。 35362. 键合相的分类键合相的分类（1）非极性键合相）非极性键合相这类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷这类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基等。十八烷基键合相基、辛烷基

22、、甲基与苯基等。十八烷基键合相（ODS）是最常用的非极性键合相。）是最常用的非极性键合相。371-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18非极性键合相常用于反相色谱。键合烷基的链长非极性键合相常用于反相色谱。键合烷基的链长增加，极性降低，载样量增大、增加，极性降低，载样量增大、k值增大，值增大，C18分分离效果优于离效果优于C8 , C138（2）中等极性键合相）中等极性键合相中等极性键合相常见的有醚基键合相（如中等极性键合相常见的有醚基键合相（如YWG-ROR

23、）。这种键合相可作正相或反相色谱）。这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。的固定相，视流动相的极性而定。（3）极性键合相）极性键合相常用氨基、氰基键合相。分别将氨丙硅烷基常用氨基、氰基键合相。分别将氨丙硅烷基Si(CH2 )3 NH2 及氰乙硅烷基及氰乙硅烷基Si(CH2 )2 CN键合在硅胶上而制成。它们可用作正相色谱的固定键合在硅胶上而制成。它们可用作正相色谱的固定相。相。 （4）离子交换键合相）离子交换键合相离子交换基团如离子交换基团如-SO3，-NR3键合在担体表面。键合在担体表面。 393. 键合相的性质键合相的性质 （1 1）稳定性）稳定性键合相在键合相在pH2

24、-8.5pH2-8.5范围内稳定，太高的范围内稳定，太高的pHpH值会值会使硅胶溶解，太低的使硅胶溶解，太低的pHpH值会使键合的烷基脱落。值会使键合的烷基脱落。 （2）键合量）键合量键合相的键合量常用含碳量键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，按来表示，按含碳量的不同，可分为高碳、中碳及低碳型键合含碳量的不同，可分为高碳、中碳及低碳型键合相。相。40高碳高碳ODSODS键合相键合相：若：若R R1 1、R R2 2是二个甲基，构成高碳是二个甲基，构成高碳ODSODS键合相键合相 Si-O-Si(CHSi-O-Si(CH3 3) )2 2-C-C1818H H3737。 中碳中碳ODSODS

25、键合相键合相：若：若R R1 1是氢，是氢，R R2 2是氯，氯与硅胶的另是氯，氯与硅胶的另一个硅醇基脱一个硅醇基脱HClHCl，则生成中碳，则生成中碳ODSODS键合相键合相 （Si-O-)Si-O-)2 2Si(H)-CSi(H)-C1818H H3737；低碳低碳ODSODS键合相键合相：若：若R R1 1、R R2 2都是氯，与硅胶的另二个都是氯，与硅胶的另二个硅醇基再脱二分子硅醇基再脱二分子HClHCl，生成低碳，生成低碳ODSODS键合相键合相 (Si-O-)(Si-O-)3 3Si-CSi-C1818H H3737。 41（3）表面覆盖度）表面覆盖度载体单位表面键合有机分子微摩尔

26、数表面覆盖度载体单位表面含有可反应的硅羟基微摩尔数覆盖度的大小决定键合相是分配还是吸附占主导。覆盖度的大小决定键合相是分配还是吸附占主导。 PartisilPartisil 5-ODS 5-ODS的表面覆盖度为的表面覆盖度为9898，即残，即残存存2 2的硅醇基，分配占主导。的硅醇基，分配占主导。 PartisilPartisil 10-ODS 10-ODS的表面覆盖度为的表面覆盖度为5050，既，既有分配又有残余硅醇基的吸附作用有分配又有残余硅醇基的吸附作用。含碳量大，则载样量大，保留能力强含碳量大，则载样量大，保留能力强42（二）正相键合相色谱法（二）正相键合相色谱法 最常用的有氰基（最常

27、用的有氰基（-C N-C N）氨基（）氨基（-NH2-NH2）、二）、二醇基（醇基（DIOLDIOL）极性键合相。流动相一般用非极性）极性键合相。流动相一般用非极性或弱极性有机溶剂，如正己烷溶剂，或其中加入或弱极性有机溶剂，如正己烷溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离能溶于有调节流动相的洗脱强度。通常用于分离能溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。4. 键合相的特点键合相的特点 固定相不易流失，寿命长固定相不易流失，寿命长 选择性好选择性好 稳定性好稳定

28、性好 传质快，柱效高传质快，柱效高 适于作梯度洗脱。适于作梯度洗脱。43分离选择性：分离选择性： 极性强的组分极性强的组分k k大，后洗脱出柱。大，后洗脱出柱。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分分k k减小，减小，t tR R 减小。减小。分离机制分离机制分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用定向作用44（二）反相键合相色谱法（二）反相键合相色谱法 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极典型的反相键

29、合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（基（ODS或或C18）键合相；流动相常用甲醇）键合相；流动相常用甲醇-水或水或乙腈乙腈-水。水。 反相色谱的保留机制还没有一致的看法，有反相色谱的保留机制还没有一致的看法，有分配与吸附之争，还有疏溶剂理论等。分配与吸附之争，还有疏溶剂理论等。键合基团的覆盖率高，分配为主；覆盖率键合基团的覆盖率高，分配为主；覆盖率低，吸附为主。如果覆盖率高，对残余硅低，吸附为主。如果覆盖率高，对残余硅醇基封尾，则吸附作用大为降低。醇基封尾，则吸附作用大为降低。45 疏溶剂理论把非极性的烷疏溶剂理论

30、把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的烷基的上覆盖了一层键合的烷基的“分子毛分子毛”，这种，这种“分子毛分子毛”有强的疏水特性。有强的疏水特性。一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从极性流动相中被分，由于疏溶剂的作用，将会从极性流动相中被“挤挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动的亲合作用，使它离开固定相，减少保留性流动的亲合作用，使它离开固定相，减少

31、保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。决定了分子在色谱中的保留行为。46保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素1、溶质的分子结构（极性）、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，极性越弱，疏水性越强，k越大，越大，tR也越大。也越大。同系物碳数越多，极性越弱，同系物碳数越多，极性越弱，k越大；越大；2、固定相、固定相硅胶表面键合烷基越大，覆盖度越大，则溶硅胶表面键合烷基越大，覆盖度越大，则溶质的质的k越大。越大。 3、流动相、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大越

32、大溶剂种类：水为弱溶剂，醇、已腈为强溶剂溶剂种类：水为弱溶剂，醇、已腈为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使溶剂比例：水的比例增加，使k增大增大47稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 固定相：十八烷基硅烷化键合相固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：30 C 柱柱 压：压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器48反相键合相色谱法是应用最广的色谱法，主要反相键合相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合用于分离非极性至中等极

33、性的各类分子型化合物物. 派生的离子抑制法、离子对法还可用于酸、派生的离子抑制法、离子对法还可用于酸、碱、盐的分析。碱、盐的分析。 在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。性小的组分后流出。（三）反相离子对色谱法（三）反相离子对色谱法 把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（在流动相中与离子对试剂的反离子（counter counter ionion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使定相的作用，使k k增加，改

34、善分离效果。增加，改善分离效果。 49原理原理 OWW)B(ABA样品离子样品离子反离子反离子 中性缔合物中性缔合物（只溶于有机相）只溶于有机相） WWOABBABAEWABWOBABAECCKmsAHHA有机碱有机碱 A固定相固定相 + NaRSONaRSO33 s33)RSO(AH)RSO(AH 离子对试剂离子对试剂水相水相50影响容量因子的因素影响容量因子的因素离子对试剂的种类和浓度：离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，碳链长度增加，溶质的溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的高，溶质的k增大增大 流动相的流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子

35、有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的化时（离子对的形成），组分的k值最大值最大固定相固定相 、流动相性质、流动相性质（同一般（同一般RP-HPLC）。）。 离子对试剂的选择离子对试剂的选择分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三）和溴化十六烷基三甲基铵（甲基铵（CTAB）等）等51分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（）、正己烷基磺酸钠（PICB6）、）、 适用范围：有

36、机酸、碱、盐等离子型和非离子适用范围：有机酸、碱、盐等离子型和非离子型化合物的混合物。型化合物的混合物。反相离子对色谱很易实现，用反相离子对色谱很易实现，用ODS柱，在流动相柱，在流动相甲醇甲醇-水或乙腈水或乙腈-水中加入水中加入0.030.01mol/L的的离子对试剂即可。离子对试剂即可。反相离子对色谱法分析奶粉中三聚氰胺反相离子对色谱法分析奶粉中三聚氰胺流动相：含流动相：含10mM柠檬酸柠檬酸和和10mM辛烷磺酸钠辛烷磺酸钠的缓的缓冲液冲液(pH3.0):甲醇甲醇=7:3 52（四）离子抑制色谱法（四）离子抑制色谱法 用反相色谱法，通过调节流动相的用反相色谱法，通过调节流动相的pH值，值，

37、抑制组分的解离，增加它在固定相中的溶解抑制组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。种技术称为离子抑制色谱法。 1抑制剂抑制剂 通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）、通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及醋酸盐）为抑制剂，调节醋酸盐）为抑制剂，调节pH值，抑制组分值，抑制组分的解离，增加中性分子存在的几率。的解离，增加中性分子存在的几率。如分离十二烷酸时，可在流动相乙腈如分离十二烷酸时，可在流动相乙腈/水中水中加入少量乙酸

38、，以抑制十二烷酸的离解加入少量乙酸，以抑制十二烷酸的离解 532容量因子及其影响因素容量因子及其影响因素 除与反相色谱法有相同的影响因素外，除与反相色谱法有相同的影响因素外，主要受流动相的主要受流动相的pH值的影响。对于弱酸，值的影响。对于弱酸，即流动相的即流动相的pH值小于它的值小于它的pka值时，主要以值时，主要以分子形式分子形式HB存在，存在，k值增大，值增大，tR增大；反之，增大；反之，pHpka ，组分以离子形式，组分以离子形式B为主，为主，k值变值变小，小，tR减小，对于弱碱，情况相反。减小，对于弱碱，情况相反。 HBBHKBHHBa 时时当当1 aKHBHB543适用范围适用范围

39、 适用于适用于3.0pKa7.0的弱酸；的弱酸；6.0pKb7.0的弱碱。对于的弱碱。对于pKa3.0的的酸及酸及pKb6.0的碱，应采用离子对色谱法或的碱，应采用离子对色谱法或离子交换色谱法。离子交换色谱法。 在进行离子抑制色谱法时，流动相的在进行离子抑制色谱法时，流动相的pH需在需在28之间之间 流动相的流动相的pH值应调节至比组分的值应调节至比组分的pK值大值大（对碱）或小（对酸）（对碱）或小（对酸）12个单位以上，使分个单位以上，使分子形式的的分布系数较大，有较大的子形式的的分布系数较大，有较大的k值。值。 55（四）分离类型的选择（四）分离类型的选择56第第4 4节节 改善分离度的方

40、法改善分离度的方法在高效液相色谱分析中，实际上固定相种类的选在高效液相色谱分析中，实际上固定相种类的选择十分有限，当色谱柱选定后，主要通过调节流择十分有限，当色谱柱选定后，主要通过调节流动相的组成改善分离动相的组成改善分离. kknR114虽然虽然n也受流动相的影响，但主要由色谱柱的性也受流动相的影响，但主要由色谱柱的性能所决定，溶剂系统主要影响容量因子能所决定，溶剂系统主要影响容量因子k和分配和分配系数比系数比。选择不同种类的溶剂或改变多元溶剂。选择不同种类的溶剂或改变多元溶剂系统的配比，都会改变系统的配比，都会改变k和和值，影响分离度。值，影响分离度。57一、对流动相的要求一、对流动相的要

41、求与固定相不互溶与固定相不互溶 纯度高纯度高 不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”粘度低粘度低 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有水、丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离. 58与检测器匹配与检测器匹配 对样品有适宜的溶解度对样品有适宜的溶解度 毒性小毒性小1.加入调节剂加入调节剂 调节调节k 二、改善分离度的方法二、改善分离度的方法使用使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长波长 ；使用折光率检测器，溶剂的折光率要；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测

42、物有较大差异。与待测物有较大差异。59 通常希望组分的容量因子通常希望组分的容量因子k保持在保持在210范围内，若组分的范围内，若组分的k值大于值大于10或小于或小于2时，可时，可通过调节流动相的极性，来获取适用的通过调节流动相的极性，来获取适用的k值。值。 在在正相色谱正相色谱中常采用饱和烷烃如正己烷中常采用饱和烷烃如正己烷作主体溶剂，加入具有不同选择性的溶剂如乙作主体溶剂，加入具有不同选择性的溶剂如乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷等，来调节溶剂的洗醚、二氯甲烷、三氯甲烷等，来调节溶剂的洗脱强度。脱强度。极性增加，溶剂的洗脱能力增强，保极性增加，溶剂的洗脱能力增强，保留时间缩短。留时间缩短。若组分的

43、保留时间短，表明溶剂若组分的保留时间短，表明溶剂的极性太大的极性太大,改用极性小的溶剂。若组分的保改用极性小的溶剂。若组分的保留时间太长，可改用极性较大的溶剂。留时间太长，可改用极性较大的溶剂。 60在反相色谱中则常采用水为主体溶剂，加入甲醇、在反相色谱中则常采用水为主体溶剂，加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等来调节溶剂的洗脱强度，乙腈、四氢呋喃等来调节溶剂的洗脱强度， 溶溶 剂剂溶剂极性参数溶剂极性参数Pk减少倍数减少倍数 * 水水 二甲亚砜二甲亚砜 乙乙 二二 醇醇 乙乙 腈腈 甲甲 醇醇 二氧杂环己烷二氧杂环己烷 四氢呋喃四氢呋喃 异异 丙丙 醇醇10.27.26.95.85.14.84.03.

44、91.51.52.02.02.22.83.0* 以加以加10%溶剂到水中，溶剂到水中，k减少的倍数。减少的倍数。 61表中溶剂极性参数表中溶剂极性参数P越大，溶剂的极性越强，在越大，溶剂的极性越强，在反相色谱中的洗脱能力越弱，保留时间延长。反相色谱中的洗脱能力越弱，保留时间延长。 当当k值值10时，可适当增加甲醇或乙腈的比例。时，可适当增加甲醇或乙腈的比例。 由于反相离子对色谱法的固定相就是普通反由于反相离子对色谱法的固定相就是普通反相键合相色谱的固定相，所以只要改变流动相的相键合相色谱的固定相，所以只要改变流动相的成分就可转变为反相离子对色谱法。常用的流动成分就可转变为反相离子对色谱法。常用的流动相是加有离子对试剂和某些改性剂的水相是加有离子对试剂和某些改性剂的水/甲醇或甲醇或水水/乙腈缓冲溶液。流动相中的有机溶剂增加，乙腈缓冲溶液。流动相中的有机溶剂增加，溶剂强度也增加，溶剂强度也增加，k值减小。值减小。通过调节离子对试通过调节离子对试剂的浓度，可改变被分离样品离子的剂的浓度，可改变被分离样品离子的k值值。 622.加入改性剂加入改性剂 改善选择性和峰形改善选择性和峰形抑制组分分子离解抑制组分分子离解 反相键合相色谱分离弱酸或弱碱样品时会发生拖反相键合