第七章核酸提取与鉴定

1、 1 核酸的提取与鉴定第一节 预处理 第二节 DNA的提取 第三节 RNA的提取 第四节 核酸的鉴定 概述 研究对象：研究对象：基因组基因组DNA、质粒、质粒DNA、总、总RNA、mRNA过程：过程： 裂解：裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中在裂解体系中 纯化：纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等如蛋白质、盐等 总原则：总原则：应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。鉴定：鉴定：浓度、纯度、分子量、测序浓度、纯度、分子量、测序 （技术：分光光度技术、凝胶电泳技术

2、等）（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）1 1、植物样品、植物样品 新鲜组织新鲜组织先用无菌生理盐水洗；干药材除去霉点，无菌水浸洗； （一）样品预处理（获取分散细胞）（一）样品预处理（获取分散细胞） 捣碎或剪碎；加液氮液氮研磨成粉状。2、动物样品新鲜样品新鲜样品，生理盐水洗，直接使用（或分装、-70/液氮低温保存）；甲醛固定组织甲醛固定组织要先去掉甲醛；石蜡包埋组织石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。 离心，弃细胞培养液； 用缓冲液多次漂洗；来源：来源：新鲜血液或者冻贮血液；抗凝剂：抗凝剂：一般用EDTA-Na2或柠檬酸钠（枸橼酸柠檬酸钠（枸橼酸钠钠 ），），不可使用肝素；肝素；分

3、离：分离：红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细胞。（血清（血清DNA是研究肿瘤的材料之一）是研究肿瘤的材料之一）3、微生物培养物样品离心获取菌体细胞，加缓冲液洗涤，加缓冲液悬浮菌体细胞。4、微生物混合样品用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。高速离心获取菌体细胞。用缓冲液洗涤菌体细胞。加缓冲液悬浮菌体细胞。 （二）提取用具预处理（二）提取用具预处理1 1、DNADNA提取用具的处理提取用具的处理 要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。2 2、RNARNA提取用具的处理提取用具的处理要求无菌，防止二次污染。 RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温，提取条件要求严格。裂

4、解细胞，溶出裂解细胞，溶出DNA除去杂质除去杂质重新溶解重新溶解DNA沉淀、浓缩沉淀、浓缩DNA 破碎细胞，溶解破碎细胞，溶解DNADNA：用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。微生物样品提取液：含表面活性剂微生物样品提取液：含表面活性剂SDSSDS、溶菌酶等、溶菌酶等动物样品提取液：含动物样品提取液：含SDSSDS、蛋白酶、蛋白酶K K等等植物样品提取液：含植物样品提取液：含CTABCTAB核酸酶可被核酸酶可被CaCa2+2+、MgMg2+2+等激活，提取液均含有螯合剂（如等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTAEDTA，柠檬酸等），螯合这些离

5、子。柠檬酸等），螯合这些离子。2、除去杂质（主要是蛋白质） （SDSSDS，破膜、蛋白质变性沉淀），破膜、蛋白质变性沉淀）苯酚抽苯酚抽提蛋白质提蛋白质氯仿抽提、萃取苯酚氯仿抽提、萃取苯酚经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯仿溶液。仿溶液。蛋白质蛋白质苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液3.沉淀DNA有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀DNADNA：2 2倍体积无水乙醇（或倍体积无水乙醇（或1 1倍体积的异戊醇）倍体积的异戊醇）再用再用75%75%乙醇清洗多次。乙醇清洗多次。4.重新溶解DNA将将DN

6、ADNA溶于水或溶于水或TETE溶液。溶液。qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取经典方法）提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。醇沉淀即可使核酸分离出

7、来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。q SDS法原理法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的淀水相

8、中的DNA。DNA提取的一般流程提取的一般流程三、质粒DNA的提取质粒质粒DNADNA特点：特点：（1 1）细菌基因组）细菌基因组DNADNA以外的小型闭合环状双链以外的小型闭合环状双链DNADNA分子。分子。（2 2）大都含有抗生素抗性基因。）大都含有抗生素抗性基因。（3 3）可自我复制或表达。）可自我复制或表达。（重组（重组DNADNA技术中构建载体）技术中构建载体）（4 4）大小）大小1-300 kb1-300 kb。1 1、培养细菌和扩增质粒、培养细菌和扩增质粒n 加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋白质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续复制。白质

9、合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续复制。 2 2、收获细菌和溶菌、收获细菌和溶菌 离心收集细菌细胞。离心收集细菌细胞。 细菌裂解方法：细菌裂解方法： 机械法机械法 化学试剂法化学试剂法 （SDSSDS） 溶菌酶化学试剂联合法（最常用）溶菌酶化学试剂联合法（最常用）3 3、分离质粒、分离质粒DNADNA 基因组基因组DNADNA与质粒与质粒DNADNA分离分离碱裂解法（最常用）碱裂解法（最常用） 用溶液用溶液1 1（EDTAEDTA）悬浮菌体。）悬浮菌体。 溶液溶液2 2（NaOHNaOH和和SDSSDS）裂解菌体，蛋白质与）裂解菌体，蛋白质与DNADNA发生变性。发生变性。 溶液溶液3 3中和中

10、和pHpH，质粒，质粒DNADNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，分子能够迅速复性，呈溶解状态，基因组基因组DNADNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。不复性与蛋白质形成絮状沉淀。 离心后，质粒离心后，质粒DNADNA留在上清液中。留在上清液中。 通过加热，使细菌裂解、蛋白质和通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNADNA变性。变性。 降低温度，质粒降低温度，质粒DNADNA复性留于上清液，基因组复性留于上清液，基因组DNADNA复性很慢复性很慢与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。煮沸裂解法（偶尔用）煮沸裂解法（偶尔用）梯度离心法（极少用）梯度离心法（极少用） 基因组基因

11、组DNADNA断裂，吸附大量断裂，吸附大量EBEB，密度大；质粒，密度大；质粒DNADNA密度小。密度小。 利用氯化铯梯度离心，分离基因组利用氯化铯梯度离心，分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA。 离心分离后，吸取含有质粒离心分离后，吸取含有质粒DNADNA的上清液。的上清液。 用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。 用乙醇或异戊醇沉淀质粒用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNADNA（与基因组（与基因组DNADNA方法同）。方法同）。4 4、质粒、质粒DNADNA的纯化的纯化蛋白质蛋白质苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液（一）总RNA的提取所

12、有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 最关键的是抑制RNA酶的活性。 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的是一种强烈但不彻底的RNARNA酶抑制剂。酶抑制剂。异硫氰酸胍：可裂解细胞并抑制RNA酶，目前被认为是最有效的最有效的RNARNA酶抑制剂酶抑制剂。 RNA酶的蛋白抑制剂(RNAsin)等。（1 1）提取）提取RNARNA所用器皿的处理及溶液的准备所用器皿的处理及溶液的准备 塑料制品：塑料制品：使用灭菌的一次性

13、用品。或用0.1DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用氯仿处理）。 玻璃用品：玻璃用品：使用前于180的高温下干烤6h以上，或在220下干烤3h以上。 有机玻璃的电泳槽等，有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再用3H2O2室温浸泡10min，然后用0.1DEPC水冲洗，晾干。 所需溶液的配制：所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。 （2 2）RNARNA提取中提取中RNaseRNa

14、se污染的控制污染的控制 1 1、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍- -氯化铯超速离心法氯化铯超速离心法 使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性； 再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清液中。 这种方法能得到高质量的RNA，同时分离出细胞染色体DNA。2 2、盐酸胍、盐酸胍- -有机溶剂法有机溶剂法 利用盐酸胍使蛋白质变性，抑制RNA酶；3 3、氯化锂、氯化锂- -尿素法尿素法 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶； 氯化锂选择性沉淀RNA。 其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA。4 4、一步快速热酚抽提法、一步

15、快速热酚抽提法 将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等联合使用，抑制RNA的降解，裂解细胞，增强对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离； 用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。 此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品，对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。 5 5、试剂盒快速提取法、试剂盒快速提取法 裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时变性； 氯仿等抽提去除蛋白质和DNA； 乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA； 此法操作简便快速。 TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂

16、解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。1）实验前取冰，）实验前取冰，4离心机预冷，离心机预冷，DEPC处理水处理水（高压灭菌（高压灭菌处理）处理）配制的配制的75%乙醇乙醇4预冷；预冷；2）1ml Trizol匀浆好的样品；匀浆好的样品；3）加入）加入0.2ml氯仿氯仿，颠倒颠倒混匀（混匀（15秒秒）“慢慢”，氯仿使蛋，氯仿使蛋白变性白变性4）室温室温，静置，静置3分钟分钟；5）离心机）离心机4、14000转转/分，离心分，离心15分钟分钟；静置；静

17、置1分钟分钟（分（分层即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，层即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相中）主要存在于水相中）6）取上清取上清0. 5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也不要吸到中间层的物质）也不要吸到中间层的物质）放入另一个放入另一个1.5ml的的EP管中；管中；7）加入等体积的）加入等体积的异丙醇异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；），涡旋混匀；8）室温室温，静置，静置10分钟分钟（该条件由（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的试剂盒提供；其他提供的条件用条件用-

18、20、1小时，目的为了更好分层）小时，目的为了更好分层）9）离心机）离心机4、14000转转/分，离心分，离心10分钟分钟10）弃上液弃上液(移液器调至移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，沿步，沿液面吸弃约液面吸弃约0.9ml上清；第上清；第2步，沿液面吸弃其余上清步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接触注意吸头不要接触到沉淀斑区）到沉淀斑区）11)沿试管内壁轻轻加入沿试管内壁轻轻加入1ml 4预冷的预冷的75%乙醇乙醇,注意切勿注意切勿冲击到沉淀斑区冲击到沉淀斑区12）离心机）离心机4、10000转转/分，离心分，离心5分钟分钟13）弃上液弃上液（用

19、枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过程中把程中把RNA烤干），烤干），60恒温箱干燥恒温箱干燥5分钟分钟（注意：打开管盖；或用（注意：打开管盖；或用真空干燥真空干燥5分钟）分钟）14）加入）加入50l DEPC处理水处理水溶解溶解（可以根据管底的白色沉淀判（可以根据管底的白色沉淀判断断RNA量的多少加量的多少加DEPC处理水）处理水）15）-80冰箱保存。冰箱保存。 （二）mRNA的提取从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）结合，其他成分被洗掉，再用低盐浓度洗脱m

20、RNA。（一）核酸浓度检测 OD2601时（比色皿厚度时（比色皿厚度1.0cm）双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml，单链单链DNA或或RNA浓度为浓度为40 g/ml。DNA(g/ml) = OD26050RNA（g/ml ） = OD26040（二）核酸纯度检测（紫外吸收法紫外吸收法） 核酸在260 nm处有吸收峰，蛋白质在280 nm有吸收峰 核酸的纯度用比值表示。 DNA样品：样品：OD / OD 1.8 ，DNA纯度高纯度高OD / OD 1.8，含，含RNA，或，或DNA部分降解部分降解OD / OD 1.8，含苯酚或蛋白杂质，含苯酚或蛋白杂质RNA样品：样品： OD / OD

21、 1.82.0 RNA纯度高纯度高 2.0，RNA出现降解出现降解（三）核酸完整性检测（三）核酸完整性检测 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。 凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。 电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸片段（0.160 kb）聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于鉴定较小的核酸片段（501000 bp）六、电泳六、电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。琼脂糖浓度() 线型DNA分子的分离范围(kb)0.35600.61200.70