综述hpv治疗现状和展望

1、综述抗HPV治疗：现况&展望在认识HPV为宫颈癌的病因至今已有25年，仍缺乏对HPV感染的有效治疗。仅仅在最近几年开始特异性的针对HPV感染的靶向综合治疗。对于HPV诱导的病变传统的物理消融术如冷冻治疗，光疗，LEEP,激光锥切和局部放疗，通过切除与含有HPV的转化角化细胞相连的病变组织从而对局部病变有一定的疗效。除了目前可获得的预防性疫苗可在暴露于病毒感染前接种从而阻止病毒入侵，现在开始研究治疗性的疫苗来治疗HPV感染。止匕外，免疫调节剂如干扰素和咪唾莫特被证实能诱发细胞因子来增强宿主对HPV感染的免疫。另外，抗病毒方法如RNA干扰核甘酸类似物，抗氧化剂和中草药衍生物被证实具有抗HPV感染的

2、治疗潜能。这些在临床前和临床研究中都得到测试。非切除的抗HPV治疗手段不仅对于早期HPV病毒尚未整合入宿主细胞基因组具有清除HPV的作用，而且对于在转化之后HPV致癌基因异常调节宿主细胞周期的阶段，对于病毒致癌基因表达具有抑制作用。导言HPV基因型的多样性与其引起上皮增生病变的广谱性能力有关。与HPV感染相关的疾病在全球疾病中所占比例非常高，估计在所有癌症中大约有5.17%与HPV感染有关。在HPV感染相关疾病中，宫颈癌作为世界女性第二常见癌症占首位。乳头瘤病毒对不同器官部位的鳞状上皮细胞展现出高的细胞向性运动并与不同的临床疾病相关如良性的上皮增生性病变如疣，乳头瘤或浸润性癌症相关。基于所致疾

3、病类型，乳头瘤病毒被分为高危型(HR)和低危(LR)型。HR-HPV(HPV16,18,31,39,45,51,52,56,59,66,68,69和73)通常与高级别病变和浸润性癌症相关，LR-HPV(HPV6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81,CP6108)常见于低级别病变，生殖器或皮肤疣和尖锐湿疣。目前大约有15种高危型HPV被认为对HPV导致的癌症有100%的作用。其中HPV16和18是最普遍的致癌基因型，二者在HPV相关的癌症病变中占据80%o特定的高危型HPV持续性感染尤其是16型和18型是CIN和宫颈癌发展的前提。尽管如此，HPV感染是一个短暂的现象。在感

4、染之后，病毒可能持续一段时间，在病毒以非整合形式存在时导致低度宫颈病变发展，而发展为宫颈癌需要1520年。尽管HPV感染的自然历程表现出很大比例的自发性消除，高危型HPV感染持续一年或更久标志着进展为癌症的风险增高。目前发现清除特定类型HPV感染需要大约2年的时间。尽管HPV基因型，一个8kb的环形DNA,编码大约6个早期基因(E1,E2,E4,E5,E6和E7)和两个晚期基因(L1和L2)。HR-HPV的E6和E7在体外试验中能使人类鳞状上皮细胞永生化，这一发现建立了病毒在宫颈癌中的作用，病毒编码的E6和E7致癌蛋白与重要的细胞周期调节蛋白相互作用。生殖器部位的HPV的E7蛋白，同于腺病毒的

5、E1A蛋白和多瘤病毒的大月中瘤抗原，能与视网膜母细胞瘤月中瘤抑制基因(pRB)形成复合体进而干扰pRB与E2F转录因子的结合，高危型HPV的E7蛋白如HPV16和18相比低危型HPV6型和11型的E7蛋白，与pRB结合的亲和力强10倍。这种结合亲和力的差别与不同E7蛋白的转化潜能有关。如同类人猿病毒40(SV40),大月中瘤抗原和腺病毒E1B,高危型HPV的E6蛋白能与P53蛋白形成复合体。E6与P53的相互作用的主要作用是与一个称为E6AP的泛素连接酶一起形成一个三重复合物。该三重复合物通过26S蛋白酶体的活化导致P53的泛素化和降解，从而使HPV感染的角化细胞中P53的半衰期降到20分钟以

6、下。E6和E7致癌特性的建立使得这些病毒基因成为抗HPV治疗的两个最重要的靶点。HPV生命周期包括四个重要的步骤，这为其病理性作用所必须且被认为是任何抗HPV治疗决策的潜在性靶点。在HPV致病过程中，病毒的入侵是第一步，随后是它在上皮细胞中持续存在。这两步使得病毒基因进入宿主细胞，是预防性和治疗性疫苗的治疗介入的目标。大部分病变中病毒作为游离基因存在并支持具有病毒基因表达紧密调节下的完全病毒复制周期。第三步也是HPV生命周期中最重要的一步：HPV基因整合入宿主基因，这一步常在CIN3或更高级别病变中观察到。整合的确切机制目前尚不完全明确，但是E2ORF的缺失和在整合之后对于E6和E7的表达和在

7、角化细胞转化/永生化抑制的释放。对于整合是否可逆也不明确。HPV基因整合过程是向恶性进展的关键点。第四步是分化上皮中病毒致癌基因转录子的表达和上调。因为HPV基因表达与上皮分化相关并能被特定的细胞因子调节。一些宿主细胞转录因子结合部位和角化细胞特异性增强子如AP-1,Sp1,NF-1,TEF-1,TEF-2,Oct-1,AP-2,KRF-1,YY1,STAT3和糖皮质激素反应元件在HPV的上游调控区域被识别，这些决定病毒基因表达的特定细胞类型和HPV的组织向性。所有四个步骤提供了干扰HPV生命周期的途径，因此代表了抗HPV治疗发展的靶点。目前的治疗方法A传统的治疗方法即使明确了HPV和宫颈癌之

8、间的因果关系，目前HPV存在与否对于治疗措施的制定并没有起到作用。这些治疗方式主要是抗癌而不是抗病毒。现在存在一些治疗HPV相关疾病的方法。这些方法本质上是切除，其目的是去除病变而不是特异性的靶向抗HPV感染。这些治疗即使有效但是仅能用于可察觉的病变而且并不一定能消除HPV感染。一些治疗存在显著的并发症如异常流液，出血，宫颈粘连（狭窄）和部分病例中宫颈机能不全和盆腔感染。即使治疗有效，所有的治疗都有高达10%的复发率。一项旨在研究CIN3中HPV感染状态与锥切有效性的研究中发现所有复发病例中持续性HPV感染很可能是由于阳性的切除边界所致。因此。这些研究强调在CIN3锥切后有持续性HPV感染的病

9、人具有增高的复发风险需要加强随访。在阴道镜出现之前，对于CIN病变认为必须切除子宫切除。但是大多数病例中CIN病变并不进展为浸?闰癌。因此对于CIN,子宫切除是不必要的且为过度治疗。同时，对于浸润性癌的管理发展很慢，通常是伴随切除原发月中瘤的标准的放疗或化疗。另一方面，推荐CIN1仅当其进展为更高病变才需治疗，否则应该随访。在这些病例中，推荐HPV检测辅助细胞学来判别疾病进展的风险和决定病变的选择性切除。在这些病例中，抗HPV治疗具有重要意义。B可选治疗细胞毒性药物对于生殖器疣，切除是首选，但在美国欧洲细胞毒性化合物如鬼臼树脂和三氯乙酸也被使用。同样5氟尿喀噬在外生殖器病变中也被有限的使用，因

10、为其可形成强烈的炎症反应。在妊娠时禁止使用鬼臼树脂和5-氟尿喀呢。这些治疗大部分表现出缺乏或不一致的抗HPV的剂量反应。目前，2个最常见的用于治疗包括宫颈癌的多种癌症的抗癌药物：三氧化二种和卡波泊被发现对两个最重要的转录因子，AP-1和NF-KB具有靶向作用，从而通过活化HPVURR,在HPV致癌蛋白E6和E7的表达中发挥重要作用。它们的抗病毒作用正在研究之中。光力学治疗（PDT）:PDT是一个用于恶性月中瘤和癌前病变的新治疗方法，也可用于一些非癌疾病。通过使用调到光敏剂分子的适当的吸收带的可见光，活化位于瘤变部位的非毒性光敏剂达到对PTD的治疗反应。产生的没有细胞毒性的物质如单线态氧，后者引

11、起局部的光氧反应、细胞破坏和月中瘤细胞毁灭从而诱发周边效应和激活宿主免疫。局部给药的PDT被认为最适用于CIN和VIN，但是临床对5-氨基乙酰丙酸的试验变现出不同的结果。虽然PDT对于各个小组不是同等有效，但是对于尖锐湿疣和上皮内瘤变，PDT与传统治疗如冷到锥切同等有效，且PDT没有大量宫颈基质的破坏，因此降低了发生宫颈机能不全的风险，但是对于HPV的消除能力与切除治疗相同。随后的研究表明PDT是一个有前途的治疗措施，因为在随访中发现的HPV感染是由于再次感染免疫治疗：干扰素是唯一获得许可用于治疗良性HPV相关疾病的抗病毒药物。IFN-aIFN-B和IFN-r均被检测是否能治疗尖锐湿疣。大部分

12、信息证实IFN-a各种给药途径均有效，给药时间和剂量均在可接受的安全范围内。在肉眼可见病变的尖锐湿疣病人切除病变后，随后给予皮下局部的IFN-a,其复发率下降。对于IFNs治疗HPV相关的瘤变和癌尚缺乏数据。联合IFN-a和类视黄醇治疗宫颈癌表现出有前途。在HPV阳性肿瘤细胞系中，联合IFN-a与类视黄醇表现出促进抗血管生成作用和上调HLA1类和细胞粘附分子ICAM-1的作用，但未探讨其联合抗病毒作用。在另一项研究中，发现IFN-a对于HPV11复制不起作用。这些治疗非常昂贵，且效用有限，不推荐其用于高级别HPV相关病变的常规临床治疗。除了直接注射干扰素，免疫调节因子，如imidazoquin

13、olone能诱发炎症细胞因子的产生，用于增强巨噬细胞和树突状细胞介导的先天免疫。咪唾莫特，作为imidazoquinolone复合物的一种，在临床试验中表现出对由于外在的HPV感染引起的生殖器疣有疗效且安全。这一类化合物形成细胞因子环境，激活树突状细胞迁移并导致Th1型反应。最近的研究表明在宫颈癌病人的淋巴结中的HPV特异性CD4+调节T细胞能抑制增殖和抑制反应性T细胞产生IFNY&IL-2细胞因子，可能是这些化合物能拮抗调节T细胞。未来的治疗方式HPV生物学最重要的事件是在临床试验中制造出强有力的预防性抗HPV疫苗：美国Merck公司的Gardasil,比利时葛兰素史克公司的Cervarix

14、。尽管如此，仍存在一系列的限制如疫苗的花费、在目标人群中的有效性、性别选择和免疫年龄阻碍了它在最近的将来有效地广泛应用。回顾这些制约因素，探索HPV感染的控制方式和对宫颈癌及其它HPV相关癌前和癌病变管理方式至关重要。现已有一些研究在探索针对病毒感染各个不同阶段的有效靶向治疗，如针对病毒入侵，病毒潜伏，病毒复制和致癌基因的表达。基于低级别和高级别病变中病毒活性是不同的，治疗方式也应该不一样并应对治疗的病变级别具有特异性。低级别病变通常是同性质的、基因稳定的，病毒复制是自由随意的。在一个免疫活性个体，治疗目的是解决这些病变，阻止病毒入侵、复制和潜伏，达到没有复发的目的。而高级别病变是异质的，遗传

15、不稳定的，病毒复制相对不活跃但是表达致癌蛋白。因此，需通过促进抗HPV免疫或者RNA干扰或转录失活病毒致癌基因的表达。未来的治疗方式应分为治疗性疫苗，抗逆转录病毒，天然/中草药衍生物。许多这些治疗正处于临床评估的后期阶段。A治疗性HPV疫苗具有病毒样颗粒（VLP）的疫苗如Gardasil和Cervarix对预防HPV感染有效但是缺乏治疗作用。基于HPV16在癌变过程中的重要作用，大部分治疗性HPV疫苗都直接针对抗HPV致癌基因E6和E7。根据免疫原的本质，治疗性疫苗可分为两大类：蛋白质/肽为基础的疫苗和DNA为基础的疫苗。大部分第一阶段临床试验研究无论是在健康个体、高级别病变或恶性月中瘤患者均

16、使用来自HPV16或18的E6和E7的整个蛋白质或肽，因为它们具有致癌潜能并在HPV相关疾病进展和癌变中始终保留并表达。这些免疫原在大多数实验中均能有效产生体液和细胞毒性T细胞反应，但是它们对病变清除衰退或在HPV阳性的效果仅在一些实验中有效。一些动物实验中观察到有前景的结果提示治疗性HPV疫苗能逆转病变进展。1期实验中记录到的参数提示尽管有有效的抗HPV免疫，但是病变衰退和HPV消除并不令人满意，而且仅在一些病人中可观察到。可能这就是治疗性疫苗未能进入II期和III期临床研究的原因。除此，仍有一些需要克服的困难如亚单位疫苗花费高、需要冷链、反应很短暂且要求一些辅助剂。为克服这些困难，第二代的

17、低花费的治疗性DNA为基础的抗HPV16E7的疫苗正在制备之中。DNA疫苗以皮下给药方式直接进入皮下的专职抗原提呈细胞形成有效地抗HPV的免疫反应。但是该方式治疗对于疾病的回归或降级的效能仍有待证明。为了修补错乱调节的宿主细胞，除了针对HPV致癌蛋白，我们可能需要识别更多的靶点。最近的研究显示结合DNA疫苗和死亡受体-5抗体或者通过RNA干扰静止fas配体能大大的增强这些疫苗的治疗潜能。除了治疗性HPV疫苗，有研究尝试用月中瘤裂解表达的HPV16抗原驱动树突状细胞（DC）。在一个试点的临床研究中发现一些DCs当用非毒性双链RNA促成熟时能诱导I类和II类T细胞免疫。这种方案目前正在宫颈癌病人中

18、进行临床测试研究。BRNA干扰为基础的治疗当认识了参与HPV相关疾病中瘤变和月中瘤生长的靶基因，便开始了对目标基因特异性治疗方法的广泛探索。前十年在特异性针对HPV致癌基因E6和E7而不损伤正常细胞RNA的RNA干扰技术方面取得很大进步。在上皮层的上层和病变高级阶段的早期阶段检测到E6和E7致癌基因的表达，因而对其蛋白RNA干扰为的靶向治疗能治疗活跃的病变。虽然有一些针对一些致癌基因的基础的治疗进入了I-III期临床研究，但其对HPV相关病变的疗效仍有待临床验证。一些体外和体内研究表明使用抗病毒核糖酶和反义分子，siRNA和shRNA的针对高危HPV靶向治疗是有效的。RNA干扰已取得了以主要抗

19、HPV16/18的E6和E7的四种不同方法。其中大部分为反义寡核甘酸和核黄素。反义或核糖酶分子的应用因其特异性和要求为了维持宫颈癌细胞恶性表型而持续表达的转化基因E6和E7很受喜爱。反义质粒或寡核甘酸对于宫颈癌细胞系的细胞增殖的效力已在一系列试验中被证明。通过互补的反义转录子抑制E6和E7导致宫颈癌和口腔癌细胞系生长速度降低及转化表型的缺失以及在动物模型上月中瘤形成的抑制。反义的E6、E7寡核甘酸同样在原发月中瘤移植组织中表现出抗增殖效力。用抗HPV16E6和E7的硫代磷酸寡核甘酸治疗HPV-16感染的Caski和SiHa细胞不仅在体外试验中降低了细胞增殖而且对植入SiHa细胞引起月中瘤的裸鼠

20、减少了月中瘤重量。使用腺病毒基因导入表达反义E6和E7基因对SiHa细胞增殖有很强的抑制作用而且体内应用对肿瘤形成有完全的抑制作用。尽管如此，反义基因的治疗性应用，其转染是一个主要制约因素，因为没有帮助传播治疗作用的旁途径，所以需要转换很高比例的靶细胞。此外，因为肿瘤细胞不能被一个抑制增殖的反义构造所消除，因此反义基因的表达需稳定。为此，正尝试将能有效表达反义E7的脂质体介导的基因转移与白介素-12细胞因子基因一起转入，该方法不仅能降低月中瘤细胞凋亡，并能作为一个抗月中瘤免疫反应。另一方面，相对传统的反义RNA,核糖酶具有一些优势。它们具有催化活性，且不要求辅酶的存在如RNaseH。除此，一份

21、子的核糖酶能结合和剪切若干个分子的mRNA,提高了扩增的净效应因此降低了用量。体外研究表明核糖酶能有效剪切HPV转录体并抑制E6/E7介导的无限增殖化。最近，成功设计出一个锤头状的核糖酶，Rz170,能特异性靶向HPV16E6E7转录体，有效抑制细胞生成及促进凋亡。Rz170在裸鼠模型上能非常有效地抑制月中瘤生长。相比之下，使用小分子干扰RNA的RNA干扰技术比反义寡核甘酸或核糖酶效率更高。最近的研究证实使用siRNA更合理，因为这些分子能诱导哺乳动物的外源病毒基因的选择性沉默，且该过程不干扰之前被病毒基因表达抑制的细胞调节系统的恢复。此外，因为E6和E7基因在正常细胞中不出现，RNAi为基础

22、的治疗不会影响正常细胞。一些研究表示HPVE6和E7能被siRNA有效抑制，从而抑制SiHa细胞单层和非贴壁依耐性生成、诱导凋亡和增值老化。SiRNA靶向的E6和E7最有趣的特征是E6靶蛋白p53的稳定性和它的核累积，从而逐渐导致HPV感染靶细胞中p21（WAF1/CIP1）的表达，视网膜母细胞瘤蛋白（pRb105）的低磷酸化，凋亡途径的活化。止匕外，将E6/E7SiRNA转染至裸鼠，在NOD/SCID鼠中观察到月中瘤结节数目的显著降低和HPV16+细胞中减慢的月中瘤生成。除了作为一个合理的抗病毒方法，RNA干扰仅在转录后水平抑制病毒致癌基因的表达，对于病毒潜伏不起作用。除此，因为缺乏旁效应和

23、要求大量的治疗原则，具有目标致癌RNA的细胞趋向放松它们的增殖能力（如需要），并在非目标或无效的表达病毒致癌基因的目标细胞的迅速扩展中被稀释。因此，考虑到RNA干扰的不足，它作为单独的治疗未必有用。一些更合理的治疗通过结合抗HPVE6和E7的RNAi治疗和当前宫颈癌的治疗方式已被开发。在最近的研究中，发现通过siRNA针对HPV致癌基因和再激活P53通路能增加月中瘤细胞对顺柏的敏感性，这种方式也减少了顺柏的剂量要求，防止了耐药的产生，导致月中瘤细胞的凋亡。在另一研究中，相比单独使用Ps-Soligo,使用光交联试剂，4,5,8-三甲基补骨脂素，共腕寡核甘酸（核甘硫代磷酸）（Ps-Soligo）

24、来光动力反义调节抗凋亡的HPV18E6的表达，与低浓度顺铝一起能更多的上调P53的活性和产生大量凋亡。体外抗宫颈癌的siRNAs研究取得了一些成果。尽管如此。核糖酶和反义分子的临床应用仍有一些制约因素，如目标选择、特异性和低效率转入、持续周期短和成本高。另外，siRNA转染可以激活应激反应基因（如GADD,p38）,有证据表明，在某些情况下,siRNA可能会降解一些人类细胞的非目标mRNAs。这种非特异性效应可能解释当细胞转染看上去无害的siRNAs后也产生细胞毒性的原因，从而强调siRNA优化的重要性。C自然/草本衍生物在这个靶向治疗的时代，目前大多数药物研发的失败使得发展安全、有效的、廉价

25、的药物被广泛关注。药物的发展因为聚焦于目标选择而不是临床疗效及安全性而受阻。该过程证实无论是HPV-相关疾病，还是一般的癌症，攻击目标本身是低效的，并在许多案例中，导致药物效果不佳且产生副作用。因为任何癌症携带基因改变估计有300个,这就引发了一个重要的问题，如何有效的抗癌靶向治疗。因此需要重新考虑药物研发策略并且注重自然/草本衍生物的研发，因为其安全性且具有多点打击能力，不仅抗病毒致癌基因且能抑制其他协同信号途径和宿主细胞的异常表达基因。因为HPV的生命周期与其感染上皮细胞的分化密切相关，许多关于宿主细胞内HPV生命周期不同阶段其活性的测定，包括病毒结合、入侵、病毒DNA游离型的存在及在宿主

26、细胞中的复制，及在病毒DNA整合入宿主细胞之后呈宿主细胞依耐性的病毒致癌基因的表达。HPV非编码的上游调节域（URR）包括无数的转录因子结合位点，像AP-1,SP1,NF-1,NFkB,TEF-1,TEF-2,Oct-1,AP-2,KRF-1,YY-1,STAT-3,糖皮质激素反应元件。在分化过程中，这些上调的细胞转录因子与HPVURR结合，加速病毒致癌蛋白和晚期结构蛋白的表达。因为这些细胞转录因子作为宿主细胞转录和病毒基因表达之间主要的联接，转录因子提供了一个抗HPV治疗的独特的靶点。理论上，结合组织转录因子能最终导致HPV致癌基因表达的抑制和终止病毒颗粒的组装。在过去的几年中，一些草药的化

27、合物、衍生物、抗氧化及小多酚植物化合物已经被使用，它们能选择性抑制宿主细胞的转录因子，如HPV感染细胞内的NF-由及AP-1。这种选择性抑制和因子构成的改变已被证明与HPV基因表达的下调和诱导感染细胞凋亡有关。我们在此介绍一些正在研究的有效地抗HPV药物。姜黄素-姜黄素是一种强有力的抗氧化剂和活跃的多年生草本化合物，亦表现出抗炎作用和抗月中瘤活性。最近的研究在HPV阳性的人宫颈癌细胞系中使用姜黄素证明姜黄素以时间和剂量依赖方式下调AP-1和NF-kB的表达。AP-1通过与与HPVURR的潜在的同源结合位点结合在宫颈癌发生过程中发挥重要作用且对于HPV致癌基因的有效表达不可或缺。AP-1被证实调

28、节几乎所有类型HPV的转录。姜黄素治疗HPV18阳性宫颈癌细胞可选择性抑制HPV18的转录并且废除AP-1与病毒URR的结合。在随后的研究中，姜黄素被证明还能抑制转录因子NF-kB的活化。姜黄素也选择性阻断IkBa磷酸化和降解，导致NFkB活化的废止和下调NF-田依赖的COX-2的表达。姜黄素的这些活性与其强大的抗氧化活性有关。基于此，一个使用姜黄素和其他草本化合物配置的复合草本乳剂，Basant,已被配制。在体外试验中它不仅能抑制HPV入侵宫颈癌细胞，还能抑制淋病奈瑟菌，不同种类的念珠菌属和HIV-lin培养。目前，该配方正在一个多中心的二期临床研究中对于患有HPV阳性CIN1/LSIL病变妇女对其抗HPV感染的有效性和安全性进行测试。Praneem:与Basant相似，Praneem也是一个多草本配方，它采用印度楝树叶的纯化提取物和其他材料，能强有力的抑制淋球群、多重耐药的大肠杆菌和不同种类