第九章DNA序列测定ppt课件

1、 即核酸即核酸DNA分子一级构造的测定，是现代分子生物学一项分子一级构造的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。重要的技术。 1963年，年，Sanger和和Thompson等人第一次完成胰岛素等人第一次完成胰岛素51个个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年年代后期，代后期，Sanger和和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序列测等人又建立了核酸序列测定的方法，定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和双脱氧末端终止法和Maxam-Gilbert化学化学裂解法将核酸序列测定技术推进到裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读

2、阶段，使核酸序列直读阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以经过测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以经过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。 在四种反响体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标志的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的延续末端。经电泳分别，放射自显影，可直接读出DNA的序列。 不论是上述哪一种方法，测序根本过程如下：不论是上述哪一种方法，测序根本过程如下： 1、制备待测、制备待测D

3、NA序列模板；序列模板； 2、酶促或化学反响将其转变、酶促或化学反响将其转变“等差数列等差数列n=1； 3、PAGE； 4、读序。、读序。P255,图图10-2 1、商品化测序试剂盒、商品化测序试剂盒 处理了质粒问题，节省了时间，处理了质粒问题，节省了时间，但缺乏灵敏性。但缺乏灵敏性。 2、自动化测序仪、自动化测序仪 以酶学测序反响或和放标测序以酶学测序反响或和放标测序产物为根底，微机处置。产物为根底，微机处置。 3、热循环测序、热循环测序 使极少数测序产物线性放大。使极少数测序产物线性放大。 4、测序商品化、测序商品化 60.-180.￥，搞定。￥，搞定。 在在DNA合成时，利用合成时，利用

4、ddNTP与与dNTP竞争掺入到竞争掺入到新生的新生的DNA链上使链终止的原理。即在链上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反响体系中，分别参与不同的种反响体系中，分别参与不同的ddNTP，其他试剂一，其他试剂一样，经酶促合成反响，生成具有一样的样，经酶促合成反响，生成具有一样的5末端，而末端，而3不不同的同的DNA片段的混合物。经电泳分别，放射自显影，片段的混合物。经电泳分别，放射自显影，直接读出直接读出DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。的多克隆位点，但方向相反。同一待测的DNA片段分别克隆到这两个载体中，用一通用引物进展测序。对于数kb大片段DNA分子，那么有几种战略，如定向克隆，内部

5、片段克隆，原位亚克隆，包含上述用2种限制酶消化DNA等。的模板构本钱身二级构造对测定的影响，将PCR与末端终止法测序结合进展，只需少量模板。一制胶一制胶二模板变性双链二模板变性双链三测序反响三测序反响 1、模板引物退火、模板引物退火 2、链延伸、链标志、链终止反响、链延伸、链标志、链终止反响 3、上样电泳、上样电泳 4、读片序、读片序 分子克隆分子克隆P640 必需经过实际才干获得技巧必需经过实际才干获得技巧段的亚克隆扩增后进展测序段的亚克隆扩增后进展测序 1、将待测、将待测DNA与与M13mp载体相连，构成重组体。载体相连，构成重组体。 2、用两种限制酶从待测、用两种限制酶从待测DNA片段的

6、一端与载体序列之片段的一端与载体序列之间将间将DNA切断，产生线性切断，产生线性DNA，使近待测，使近待测DNA片段的一端片段的一端为为5突出末端，近载体一端为突出末端，近载体一端为3突出末端。突出末端。 3、外切核酸酶、外切核酸酶从从5突出末端消化待测突出末端消化待测DNA，37C时，每分钟水解时，每分钟水解250个核苷酸个核苷酸 4、核酸酶、核酸酶SI去除剩余单链，自我环化，转化或转染宿去除剩余单链，自我环化，转化或转染宿主菌得到次级克隆。主菌得到次级克隆。 5、将各克隆用于测序。、将各克隆用于测序。三引物延伸法三引物延伸法 是一种定向测序法，从是一种定向测序法，从DNA的的3依赖特定引依

7、赖特定引物延伸测定一段物延伸测定一段DNA序列，再根据测得序列设计序列，再根据测得序列设计新的引物，作下一延伸反响的引物，如此向前推新的引物，作下一延伸反响的引物，如此向前推进，最终测得进，最终测得DNA的全长序列。的全长序列。 化学裂解直读，化学裂解直读，Sanger双脱氧末端法也是直读法双脱氧末端法也是直读法法是法是Maxam和和Gilbert等人等人1977年创建的，用来测定年创建的，用来测定DNA序序列。化学法是用化学试剂在列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链等差数列片段，产生一簇各种长度的短链等差数列 n=1，经过，经过PA

8、GE和放射自显影后，可以直接读出和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。的顺序。 某些试剂能修饰或破坏某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而链上特定核苷酸的碱基进而使使N-糖苷键断裂，暴显露的糖环以糖苷键断裂，暴显露的糖环以-消除反响，在消除反响，在3和和5位上断裂磷酸二酯键。使戊糖零落，用于嘌呤环的试剂是硫位上断裂磷酸二酯键。使戊糖零落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。4种核苷酸的特异裂种核苷酸的特异裂解和鉴别方法如下：解和鉴别方法如下： 化学法没有末端终止法运用广泛，但有一个明化学法没有末端终止法运用广泛，但有一个明显的

9、优点，即所测序列来自原显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促分子而不是酶促合成反响所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合合成反响所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进展测序，可以分析诸如甲基化等成的寡核苷酸进展测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能经过化学维护及修饰干扰实修饰的情况，不能经过化学维护及修饰干扰实验来研讨验来研讨DNA二级构造及蛋白质与二级构造及蛋白质与DNA的相互作用。的相互作用。 化学法测序放射自显影图谱的识读，较末端法更复杂一些，这是由化学法测序放射自显影图谱的识读，较末端法更复杂一些，这是由于化学裂解反响并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为于

10、化学裂解反响并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为4或或5条垂直条垂直的阶梯带，的阶梯带，AC反响可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，反响可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和和C+T两列中含有一切相差一个碱基的两列中含有一切相差一个碱基的DNA片段。假设片段。假设G+A中出现中出现1条带就条带就看看G列中能否有同样大小的带，假设有即为列中能否有同样大小的带，假设有即为G碱基，无那么为碱基，无那么为A碱基；同碱基；同理，理，C+T中那么检查中那么检查C列中有无同样大小条带，有即为列中有无同样大小条带，有即为C，无那么为，无那么为T。在做了在做了AC反响时，出现较深的带时，可以协助确定为反响时，出现较深的带时，可以协助确定为A碱基。化学法必碱基。化学法必需需4或或5个反响管一致阅读，个反响管一致阅读，DNA中中4个碱基每个位置都有个碱基每个位置都有1个相应的片段，个相应的片段，待测的待测的DNA全部序列可直接读出。专业技术人员全部序列可直接读出。专业技术人员 化学法测序采用化学法测序采用32P标志