酶联免疫吸附试验

1、 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验基本原理：基本原理：把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；并将抗原或抗体与某种酶连接成酶标记抗原或抗体，它即保留了免疫活性，又保留了酶的活性；测定时将受检样品（含待测抗原或抗体）和酶标记抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物；用洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定比例；加入底物后，底物被固相载体上的酶催化变成有色产物，通过定性或定量检测有色产物量即可确定样品中待测物质含量。ELISAELISA法三个必要试剂：法

2、三个必要试剂：固相抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶反应的底物。检测抗原的方法检测抗原的方法: :1.双抗体夹心法2.双位点一步法3.竞争法检测抗体的方法：检测抗体的方法：1.间接法2.双抗原夹心法3.竞争法4.捕获法双抗体夹心法基本原理：基本原理：固相抗体固相抗体待检抗原待检抗原酶标记抗体酶标记抗体底物底物 类风湿因子（类风湿因子（RF）存在可出现假阳性）存在可出现假阳性 双抗体夹心法二价或二价以上的较大分子抗原的测定，不能用于半抗原的测双抗体夹心法二价或二价以上的较大分子抗原的测定，不能用于半抗原的测定。定。 临床上常用于乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、临床上常用于乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、

3、HCG等的测定。等的测定。双位点一步法要求：要求：抗原分子上存在两个不同且空间距离较远的决定簇。 原理：原理：使用两种单克隆抗体，即包被使用一种抗体，酶标记使用另一种抗体。测定时将含待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体腹部干扰，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。注意：注意：当待测抗原浓度过高时，过量抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应，显色降低，严重时可出现假阴性结果。竞争法原理：原理：测定管测定管固相固相抗体抗体待检待检抗原抗原酶标酶标抗原抗原底物底物显色反应显色反应弱弱对照管对照管强强竞争法特点：特点： 酶标记抗原与样品或标准品种

4、的非标记抗原具有相同的 与固相抗体结合的能力； 反应体系中，固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和； 免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量（酶活性）与样品或标准品种非标记抗原的浓度呈反比。检测抗体的方法间接法：间接法：检测抗体最常用的方法，属非竞争性结合实验。原理：固相抗原固相抗原待测抗体待测抗体酶标抗抗体酶标抗抗体底物底物显色反应显色反应间接法采用的酶标抗抗体仅针对一类免疫球蛋白分子，通常用的都是间接法采用的酶标抗抗体仅针对一类免疫球蛋白分子，通常用的都是抗人抗人IgG,所测的仅为抗体的所测的仅为抗体的IgG类，不涉及类，不涉及I

5、gA和和IgM类。类。间接法优点：优点：只需更换固相抗原，就可用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性。应用：应用：常用于丙型肝炎病毒抗体、人免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体等。双抗原夹心法优点：优点：可检测各类抗体，灵敏度和特异性高于间接法。 机体产生抗体IgG的效价有限，不会出现钩状效应。原理：原理：与双抗体夹心法类似。应用：应用：乙型肝炎表面抗体竞争法应用：应用：乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）、乙型肝炎病毒e抗 体（HBeAb）原理：HBcAb竞争法：将核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原，加入待测标本和酶标记的特异性核心抗体，待测标本中的HBcAb与酶标记HBcA

6、b竞争与固相上核心抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色强弱与待测标本中的HBcAb含量成反比。HBeAb竞争法：将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体，同时加入待测标本和中和抗原HBeAg，待测标本中的HBeAb和固相抗体竞争结合中和抗原HBeAg，待测标本中HBeAb浓度越高，与固相抗体结合的HBeAg越少，反之亦然；温育后洗涤，加入酶标记特异性抗体，酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合；温育后洗涤，加底物显色，显色强弱与待测标本中的HBeAb含量成反比。捕获法（反向间接法）捕获法常用于病原体急性感染诊断中的捕获法常用于病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗体，型抗体，IgGIgG可干可干扰测定扰测定。原理：原理：固相抗固相抗IgM抗体抗体待检抗体待检抗体已知抗原已知抗原酶标抗体酶标抗体底物底物显色显色反应反应特异性特异性IgM抗体抗体非特异