纤维素降解菌的分离与鉴定

1、环境中纤维素降解菌的筛选和初步鉴定实验目的 从环境中筛选出能降解纤维素的菌株 初步鉴定出菌株所属的类型 纤维素酶酶系组成及降解机理 纤维素酶酶系包括内切葡聚糖酶(Cx酶）、外切葡聚糖酶(Cl酶)，来自真菌简称CBH，来自细菌简称Cex)和B葡聚糖苷酶l，也称纤维二糖酶，简称BG)。滤纸酶(FPase)活力代表了三种酶协同作用后的总酶活力。 纤维素是有许多葡萄糖分子通过-1，4一糖苷键连接起来的大分子物质，对其的水解需要上述三种酶的共同作用。酶的种类完整性、各种酶之间的比例关系等都会影响到纤维素酶的整体活力。 纤维素酶的来源 自然界中存在大量可以产生纤维素酶的微生物，真菌、细菌、放线菌等。 咀纤

2、维素为食的反刍动物，牛，驴等，其胃肠内就存在大量的产纤维素酶的微生物。 一些昆虫，如白蚁的肠道也可咀产生纤维素酶。 来源不同的纤维素酶其特点也不尽相同，由此构成了各具特色的纤维素降解酶系。 真菌所产的纤维素酶特点： 胞外酶、往往酶活较高、易于收集检测，对于天然纤维索的降解也有较好效果。以丝状真苗中的木霉属作为产酶真菌被研究最为透彻。 细菌所产的纤维素酶特点： 纤维素酶量较少，大多为胞内酶，对于天然纤维素的降解能力也较弱。细菌中如芽孢杆菌可以产生碱性纤维素酶。 放线菌所产的纤维素酶特点： 往往具有耐碱的特性，部分菌株产生的纤维素酶活力也较高，结构简单。 培养基原理纤维素培养基 作为初筛时的富集培

3、养基，得到各种类型的纤维素降解菌。纤维素刚果红培养基 刚果红培养基能使产纤维素酶的菌株在平板上形成水解圈。 纤维素是由葡萄糖残基以 -1, 4糖苷键连接而成的线状大分子物质, 纤维素水解酶能水解此糖苷键, 使其变为纤维二糖和葡萄糖,水解后的糖类同刚果红染料形成红色沉淀,颜色浓郁,厚重,所以此水解圈在菌落生长过程中清晰可见,不易发生错误识别。 培养基：纤维素培养基、纤维素 刚果红培养基 样品：含腐叶的土壤。 仪器及其他用品：酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、滴管、试管、培养皿、锥形瓶、枪头、涂布器、滤纸。2. 物品准备3. 灭菌4. 铺试管斜面，倒平板6. 分离7. 纤维素降解菌的纯化8. 形态观

4、察及初步鉴定5.初筛1.培养基的配制及分装培养基的配置和分装纤维素琼脂培养基： (NH4)2SO4 2 g , MgSO4 7g， H2O 1 g , NaCl 1 g , CaCO3 2 g , 水 500mL , 121 灭菌20 min，倒平板后,盖上与平板大小一致的无菌滤纸（注意：滤纸要用稀醋酸浸泡一夜 ，用碘液检查是否有淀粉 ，若已去除完全 ， 则用 2苏打水冲洗至中性，干热灭菌后备用 ）。 物品准备 盛有9 mL水的试管，6支（试管用胶塞塞住） 在容积为250 mL的三角瓶内加入玻璃珠，以盖住瓶底为宜（作用：打散土壤结块），再加入90 mL蒸馏水，1瓶 试管斜面 8支 平板9个 1

5、 mL枪头盒，1盒 涂布器8支 滤纸9个培养基的配置和分装 纤维素刚果红培养基： K2HPO4 0 . 5 g , CMC- N a 1. 88 g , M gSO47H2O 0 . 25 g , 明胶 2 g , 刚果红 0. 2 g , 琼脂 14 g , 土壤浸出液 100mL（灭菌后加） , H2O 900mL, pH值为 6 7。初筛以下各步骤均在无菌条件下进行。（1）称取土壤样品10 g，倒入含有90 mL水和玻璃珠的三角瓶中振荡5 min，使土样充分打散。（注意：等水冷却了再倒入土样。）（2）取 5 mL悬液加入盛有 50 mL富集培养基 (纤维素琼脂培养基 )的三角瓶,在 28

6、 和 150 r/min下, 振荡培养 3 5 d后移取 5mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继续培养。分离（1）无菌条件下，取富集后的培养液将土壤悬液稀释成10-110-7系列浓度。（2）分别用移液器精确地吸取各稀释菌液0.2 0.3 mL，对号先后涂布于编好号刚果红培养基平板,（涂布时涂布棒要从浓度小的梯度开始，将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌）。置于 30 培养箱中，倒置培养一周。 （3）分别挑选出透明圈大的菌落,即为分解能力较强的菌纤维素降解菌的纯化(1)在无菌条件下，挑取单菌落的孢子“之”字划线于试管的斜面上，在上方盖上一条滤纸。(2)将试管置于2830oC的培养箱中培养一周。形态观察与鉴定直接观察：在培养基中，整体观察菌落特征及其颜色，确定其所属类型。印片观察：取一小块带培养基的菌落正放于载玻片上，然后用另一载玻片加热后按压，注意不要滑动玻片。取上面的印片，有印迹的一面朝上，在40 x物镜下观察。如需染色，先将有印迹的载玻片通过火焰23次固定，再用美蓝染色观察（染色1 min，水洗，干燥后观察），对细菌可进行革兰氏染色, 在显微镜下观察其菌株形态, 并初步鉴定其种类。实验结果与分析 在纤维素分解菌的筛选过程中, 本试验采用了2种分离纤维素分解菌的培养