定量RTPCR原理

1、竞争性RT-PCR PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性序列量的起始比例。 理想情况下，靶序列与参照物以相同的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开。竞争性RT-PCR参照物片段分两类:- 同源性片段与靶序列只有微小差别- 非同源性片段除两端引物模板区以外与靶序列不同竞争性RT-PCR面临的问题变异主要来源是样品RNA的纯度和完整性，应设内源性参照物。若使用DNA参照物，反转录酶的效率未受控制。RT-PCR定量的条件 确定PCR反应曲线上的有效范围，即在平台效应出现以前PCR扩增得到的终产物与加入的RNA数量呈线性关系。 确定足够的样品数，保证可对PCR扩增产物量间差异进行统计分析。非竞争性RT-

2、PCR 目前主要采用荧光实时RT-PCR，放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。实时RT-PCR 实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产物变化曲线。 根据PCR 变化曲线计算出目标靶基因分子数。传统RT-PCR与实时RT-PCR的流程比较荧光定量RT-PCR基本流程荧光测定的光学原理图荧光测定的光学原理图滤镜轮滤镜轮CCD相机相机光源光源滤光镜滤光镜96孔板孔板多元镜多元镜双色镜双色镜夫累舍尔透镜夫累舍尔透镜96孔透镜组孔透镜组反射镜反射镜Molecular Beacon MethodDye Incorpora

3、tion MethodHybridisation Probe MethodTaqmanTaqman荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术特异性荧光特异性荧光 标记探针标记探针TaqTaq酶酶 53 53 外切酶活性外切酶活性设置内参照 分为两种：在扩增反应中加入的外源参照物和样品中正常存在的内源参照物。 内源性参照物通常使用“管家” 序列或rRNA。实时RT-PCR特点 扩增反应处于对数增长期，无平台效应。 无需处理PCR反应产物，减少污染。 检测范围更宽，速度更快。ApplicationQuantificationMutation/Allele detectionMultiplex RT-PC

4、R Detection of mRNA splice variantsMutation/Allele detectionUse different reporter dyesOne increase homozygosityTwo increase heterozygosityMultiplex RT-PCRAdvantage: Time and reagent savingLimitation: availability of multiple reporters excitation and detection ability多重定量多重定量PCRPCR结果结果TNF-, TGF-, TN

5、F-and lymphotoxin-amplifications (FAM)in replicates of 5 18S ribosomal RNA endogenous control amplifications (VIC) showing all 20 sample wellsDetection of mRNA splice variants主要内容主要内容1. Taqman探针原理2. CT值和阈值的确定3. ROX内参比荧光的作用4. IPC内对照的作用退火，开始延伸退火，开始延伸535535ForwardPrimerReversePrimerTaqMan ProbeRQ替换替换53

6、5535ForwardPrimerReversePrimerRQ剪切剪切535535QR延伸结束延伸结束535535RQ荧光定量荧光定量PCRPCR实验荧光强度的计算公式实验荧光强度的计算公式Rn=总荧光强度RB=基本（空白）荧光强度XO=靶基因起始拷贝数EX=扩增效率（0 EX 1）n =扩增循环数RS=每个荧光分子的荧光强度SnXOBnREXRR)1 ( 达到阈值时的计算公式达到阈值时的计算公式RB, Rs 和 Ex 是确定的Rn=RT=阈值n=CT= 达到阈值时的循环数SCXOBTREXRRT)1 ( C CT T的推导过程的推导过程RT =RB+XO(1+Ex)CTRs log(RT

7、-RB)=log XO +CTlog(1+ Ex)+logRsCTlog(1+ Ex)=log(RT -RB)-log XO -logRs)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXCCT = -k logX0 + bCt起始DNA拷贝数C CT T值与起始值与起始DNADNA拷贝数的关系拷贝数的关系Rn (荧光信号)Cycle Number（循环数）Threshold（阈值）阈值的作用：确定阈值的作用：确定C CT T值值阈值 = 基线（背景）信号均值基线（背景）信号标准偏差 x 10基线的范围：从第3个循环起到指数增长开始前3个循环止。一般取3-15循环。确定阈

8、值的标准：基线确定阈值的标准：基线基线阈值标准偏差3个循环阈值选择的推导原理阈值选择的推导原理1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的2. 偶然误差的结果满足对数分布3. 阈值 = 基线（背景）信号均值基线（背景）信号标准偏差 x 104. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于1055. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光信号强度可以测量得到SampleNo TemplateThresholdBaselineRn+Rn- RnCtPCR PCR 反应曲线反应曲线未知样品标准品：产生标准曲线内参比（Internal Standard）ROX

9、校正样品管和加样误差内对照（Internal Control）：校正扩增效率的误差+/-对照：检验试剂和仪器的可靠性6次重复：满足统计学要求定量准确的要素定量准确的要素多色荧光技术多色荧光技术准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正检材和对照最好在同一反应管中，误差最小多重检测要求仪器有多种荧光检测能力只有ABI的仪器才具有四色检测能力：uFAM：标记目的基因探针uVIC：标记第二个目的基因或IPC探针uTAMRA：淬灭基团uROX： 内参比荧光使用使用ROXROX内参比的效果内参比的效果使用使用ROXROX内参比的好处内参比的好处 报告荧光报告荧光参比荧光参比荧光样品管1样品管2不使用参比荧

10、光校正的结果使用参比荧光校正的结果ROXROX荧光内参比的作用荧光内参比的作用以固定浓度存在于TaqMan PCR缓冲液中，常用ROX荧光强度均一化(Normalize)： Rn = RReporter / RROX， Rn = Rn,sample Rn,blank影响荧光信号强度的因素包括：u光纤出口处的激光强度；管盖厚度、透光性u缓冲液和反应体积等校正管间差异，保证实验结果的重现性5 Nuclease Multiplex Assay5 Nuclease Multiplex AssayFAM dye labeled 35S TargetVIC dye labeled ER阳性内对照阳性内对照

11、(IPC)(IPC)为操作方便，取样一般以克或uL为单位IPC一般选用基因组中单拷贝的管家基因，其定量结果代表了基因组的数量，也就是检材中细胞的数量。CT = CT Sample - CT IPC将定量结果校正为以基因组为单位，不同样品之间具可比性。阳性内对照阳性内对照(IPC)(IPC)IPC除了用于计算CT，校正定量结果外，还可以起到阳性对照的作用，用于判断阴性结果的真伪。u真阴性检材-；IPC+u假阴性检材-；IPC-常用的内对照：u18S rRNAu-actinuGAPDH标准品的选择标准品的选择标准品可以从ABI购买，也可以自己制备标准品的单位并不重要，取决于对最终结果的要求：拷贝数

12、，%，ng/uL, mol/uL如转基因定量的国际标准是%(w/w) ，标准品最好是先将不同重量比的转基因与非转基因食品粉末混合，然后抽提DNA；不要先抽好DNA，再用水梯度稀释如果要得出的是样品中的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的DNA目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 40 = 40IPC (VIC layer) IPC (VIC layer) 基因基因CtCtVICVIC = 27 = 27内对照用于确认阴性结果内对照用于确认阴性结果目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 40 = 40IPC (VIC layer) IPC (VIC layer) 基因基因CtCtVICVIC = 40 = 40假阴性结果假阴性结果目的基因目的基因CtCtFAMFAM = 29