金银花中绿原酸的提取及检测_乌兰

1、下,随着球磨时间的增加，其剪切应力显著下降。用幕方程r=ky我#k为稠度系数;m为流动特征指数对曲线进行拟合，结果如表2所小。由拟合结果可知，在不同温度下，相关系数R2在0.98500.9993之间，这说明方程与曲线有较好的相关性。同一样品的稠度系数k随着温度的升高而减小，说明温度升高可以减小体系的稠度，增强淀粉糊的流动性。在同一温度下随着球磨时间的增加，稠度系数k显著下降，流动指数m则是呈现增加的趋势，说明球磨后的绿豆淀粉更趋近于牛顿流体。3结论上述实验结果表明，机械球磨方法可以有效地将绿豆淀粉非晶化，球磨一定时间后淀粉颗粒的偏光十字消失,X-射线衍射曲线的尖峰彳方射特征逐渐减弱，绿豆淀粉颗

2、粒的结晶结构受到严重破坏。球磨处理后绿豆淀粉糊的流变特性在不同浓度和温度下发生了变化，绿豆淀粉糊随着球磨时间的延长稠度系数k不断减小，而流动特征指数m则不断增大，说明球磨处理后绿豆淀粉糊趋向于牛顿流体的特征。参考文献:1ShinjiTamaki,MakotoHismatsu,KatsunoriTeranishi,etal.Structuralchangeofmaizestarchgranulesbyball-milltreatmentJ.Starch,1998,50(8:342-348.2ShinjiTamaki,MakotoHisamatsu,KatsunoriTeranishi,etal.

3、Structuralchangeofpotatostarchgranulesbyball-milltreatmentJ.Starch,1997,49(11:431-438.3胡飞，陈玲，李琳.马铃薯淀粉颗粒在微细化过程中结晶结构的变化J.精细化工，2002,19(2:114-117.4ShermanP.FoodtextureandrheologyM.NewYork:Aca-demicPress,1979.5PrenticeJH.MeasurementsintherheologyoffoodstuffsM.London:ElsevierAppliedSciencePublishers,1984.

4、6胡飞，李平凡，陈玲.微细化马铃薯淀粉流变性质的研究J.粮食与饲料工业，2002,(7:4143.7二国二郎.淀粉科学手册M.王微青，等，译.北京：轻工业出版社，1990.31-43,163-167.8MohdNurulIMuhd,AzemiBMN,MananDMA.Rheologicalbehaviourofsago（MetroxylonsagustarchpasteJ.FoodChemistry,1999,64:501-505.收稿日期:2004-07-14*通讯作者基金项目：天津市教委科研项目（20039902作者简介：乌兰（1976-,女，硕士研究生，研究方向为食品科学、天然产物开发。

5、金银花中绿原酸的提取及检测乌兰，张泽生*（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300222摘要:采用多种方法分别从金银花中提取绿原酸，用紫外光谱法和高效液相色谱法对其进行定性定量分析。同时用金银花乙醇提取物对大肠杆菌进行抗菌试验。绿原酸提取试验结果表明：用70%乙醇热回流提取是金银花中绿原酸提取的最佳方法，获得绿原酸的提取率高于其他方法，提取终产物与标准品的最高吸收峰均在324nm处，终产物中绿原酸的含量为43.35%。抗菌试验结果表明：金银花提取物具有较强的抑菌活性。关键词：金银花;绿原酸;提取;检测;抗菌活性ExtractionandExaminationofChlorogenicAc

6、idfromFlosLoniceraeWULan,ZHANGZe-sheng*(FoodEngineeringandBiologyTechnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300222,ChinaAbstractOptimizationoftheextractingmethodofchlorogenicacidfromFlosLoniceraewasstudiedbyseveraldifferentmethods.TwodifferentwaysofUltraviolet(UVandVisibleSpectrophoto

7、metrandHighPerformanceLiquidChromatography(HPLChavebeencarriedoutforthequantitativeandqualitativedeterminationofchlorogenicacidinFlosLonicerae.InhibitiontestagainstpathogenicbacteriahasbeendonewithFlosLoniceraeethanolandchlorogenicacid.Theresultsofchlorogenicacidextractionshowedthatchlorogenicacidti

8、ptopabsorb-apexwas324nm,withethanolof70%concentrationextractionwasremarkablysuperiortoothermethods.Thecontentofchlorogenicacidwith70%ethanolextractionwas43.35%,sotheethanolwith70%concentrationextractionwastheoptimumcondition.TheantibacterialactionofchlorogenicacidinvitroonEscherichiaColiandextracted

9、with70%ethanolfromFlosLoniceraeshowedthatFlosLoniceraehadstrongantimicrobialactivity.Keywords:FlosLonicerae;chlorogenicacid;extraction;examination;antimicrobialactivity中图分类号:TS207.3文献标识码:A文章编号:1002-6630（200505-0130-05金银花为忍冬科（Caprifoliaceae忍冬属（Lonicera植物忍冬（Lonicerajaponicathunb及同属多种植物的干燥花蕾，它是一种药食同源”的

10、绿色植物，是临床常用的中药之一。近代研究一般认为金银花的生物活性有效成分为绿原酸类化合物，并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的优劣1o绿原酸具有显著的清热解毒、抗菌消炎和抗衰老作用；对消化道的癌症有明显的抑制作用；还具有抗生育作用及对免疫系统的调节作用；绿原酸还具有增香和护色作用，可用于食品和果品保鲜。绿原酸是含有竣基和邻二酚羟基的有机酸，易溶于水、醇溶液和丙酮等溶剂。目前，从金银花中提取绿原酸多采用水煎法、水提醇沉、稀醇回流法、动态浸提法、超声波法和渗漉法等，国内学者对绿原酸不同提取工艺的评价仍存在分歧，但多数认为乙醇回流法较好。为进一步优化乙醇回流法的提取工艺，本文进行了金银花中绿原

11、酸的提取试验，并采用紫外分光光度法及中华人民共和国药典（2000年版要求采用高效液相色谱法（HPLC等作了相应的含量测定，以及经典的生物检测法2,3对金银花提取物的生物活性进行检测。1材料与方法1.1 材料1.1.1 试验材料河南金银花。1.1.2 试验菌株大肠埃希氏菌（EscherichiaCoil,G-,购自湖北武汉大学中国典型培养物保藏中心。1.1.3 培养基固体肉汤培养基g/L:蛋白豚10.0，牛肉浸膏5.0,NaCl5.0,琼脂20.0,pH7.2,121C灭菌20min;半固体肉汤培养基g/L:蛋白豚10.0，牛肉浸膏5.0,NaCl5.0，琼脂8.0,pH7.2,121C灭菌20

12、min;琼脂培养基g/L:琼脂20.0,121C灭菌20min。1.1.4 实验仪器KDF-2116康达多功能食品粉碎机（天津市达康电器公司彳散量进样器（基因公司,ORION818型pH计（美国,RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器，SHB-田循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸，调温加热套（河北省黄骅市中兴，超净工作台（苏净集团,HPS-250生化培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器，AB204-N分析天平（美国Mettler-ToledoGroup,Uvmini-1240紫外可见分光光度计（日本岛津有限公司，高效液相色谱仪（美国Lab,数码相机CASIO（日本，游标卡尺。1.1.5 主要试剂无

13、水乙醇、甲醇、氯化钠、柠檬酸、三乙胺（分析纯、乙月青（色谱纯，绿原酸标准品（Sigma公司，庆大霉素（华北制药厂，生产批号：20040218,80万单位/2ml。1.2 实验方法1.2.1 绿原酸的基本提取工艺1.2.1.1 破碎水提取时将金银花低温烘干后切至0.60.8cm;乙醇提取时将烘干后的金银花用粉碎机破碎至约20目；1.2.1.2 热回流浸提破碎后将金银花置于磨口圆底烧瓶中，加入适量的水或乙醇溶液，用调温电热套加热至微沸状态，热回流2次,第一次1h,第二次0.5h;1.2.1.3 抽滤用布氏抽滤器减压处理浸提液；1.2.1.4 浓缩合并浸提液，用薄膜旋转蒸发器减压浓缩（40C至无乙醇

14、味，回收的乙醇待用；1.2.1.5冷沉离心将浓缩液置于4c冷藏24h后10000r/min离心30min,取上清，同时将沉淀用少量蒸储水再洗脱一次，离心后合并两次上清液，定容。1.2.1.6 真空冷冻干燥将提取液先于超低温冰箱中冷冻0.5h然后至于真空冷冻干燥剂中干燥成粉末。1.2.2绿原酸的检测对金银花中绿原酸定性定量的测定有颜色反应法、容量法、极谱法、比色法、紫外分光光度法、三波长分光光度法、导数光谱法、纸层析一比色法、纸层析一紫外分光光度法、薄层光密度法、薄层层析一紫外分光光度法、薄层扫描法、气相层析法、GC-MC法、高效液相色谱法（HPLC及生物检测法。本试验采用紫外分光光度法及高效液

15、相色谱（HPLC法，以及经典的生物检测法一一管碟法对金银花提取物的生物活性进行检测。1.2.1.7 紫外分光光度法（1标准曲线的绘制准确称取绿原酸标准品5.0mg,用30%甲醇溶解并定容于50ml容量瓶中。再准确量取标准溶液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00ml分别于10ml比色管中，用30%甲醇溶液定容。取0.05mol/L的绿原酸标准溶液用紫外分光光度计于200500nm扫描。然后选取最大吸收波长分别测定不同浓度标准溶液的吸光度值（OD值,以绿原酸标准品浓度（g/L为横坐标，以其吸光度值（OD值为纵坐标绘制标准曲线。（2绿原酸含量的测定将不同提取

16、工艺所得供试品各取1ml用30%的甲醇溶液定容至1000ml;在324nm处测其吸光度值，以计算其中绿原酸的含量及提取率。绿原酸含量=根据标准曲线测得含量/原金银花质量绿原酸提取率=根据标准曲线测得含量/原金银花中绿原酸总含量1.2.1.8 高效液相色谱法（HPLC（1分析条件柱:Lab250mmX4.5mm,C18分析柱，流动相为乙月青：柠檬酸缓冲溶液：水（10:20:70,流速为1.0ml/min,室温，进样量为20仙检测波长为324nm。（2对金银花中绿原酸的定性分析本试验利用HPLC在相同色谱条件下，将标准溶液色谱图与样品色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的绿原酸等活性物质。（3标

17、准曲线的绘制以不同质量浓度的绿原酸标准溶液各20仙分别进样，测定其峰面积。以绿原酸标准品浓度（g/L为横坐标，以与其相应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，再取不同工艺条件提取的待测液用同样方法测定其峰面积以求出绿原酸含量。1.2.3金银花提取物抑菌活性实验一一生物检测法本试验采用测量抗生素效价的牛津杯法对金银花提取物进行效价的测定。牛津杯法（又称管碟法是利用抗生素在营养琼脂培养基中的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有敏感性实验菌的营养琼脂表面进行扩散渗透，由于抗生素对被试菌的抑制作用而产生透明抑菌圈，抑菌圈的大小和抗生素的浓度之间有一定的比例，从而确定抗生素效价的一种方法。这个

18、方法是利用抗生素可以抑制敏感菌的特点，既符合临床使用的实际情况，而且灵敏度高，又不需要特殊设备，因此被国际公认。本试验采用管碟法对绿原酸的最低抑菌浓度（MIC进行了测定，利用大肠杆菌（EscherichiaColiG+作为敏感试菌。具体方法如下：无菌操作。取10ml琼脂培养基于直径为9cm的无菌培养皿中，铺匀，待凝固后，放入两个牛津杯；取含有活菌数为106108/ml的半固体培养基10ml,加到装有牛津杯的培养皿中，铺匀，待凝固后，拔出牛津杯；在其中一个杯孔中加入50仙不同工艺条件提取的、一系列浓度梯度的金银花提取液或绿原酸纯品；另一个孔作空白对照以便观察所接菌的生长情况，37C培养2448h

19、后,观察抑菌圈的大小和透明度，相同条件作三个平行；恰好没有抑菌圈出现的培养皿所用的溶液浓度为最小抑菌浓度（MIC。将稀释一系列的庆大霉素也用上述步骤作阳性对照试验。2结果与分析2.1 紫外分光光度法对绿原酸含量的测定将绿原酸标准溶液配制成浓度为0.05mol/L,用紫外分光光度计于200500nm扫描，如图1所示，绿原酸的最大吸收峰在波长为324nm处,故选取324nm。分别测定不同浓度标准溶液的吸光度值（OD值,做出标准曲线，如图2所示。求得线性回归方程为Y=57.497x+0.0482,R2=0.9999,说明本方法在绿原酸的质量浓度为0.0050.03g/L时具有良好的线性。在不同工艺条

20、件对金银花的提取液在324nm测其吸光度值经过公式计算结果如图3。根据用紫外分光光度法测定绿原酸的含量、提取率与成本来看，应选取70%乙醇进行对绿原酸的提取，提取率可达96.81%,终产物中绿原酸的质量百分数为43.35%。2.2 用高效液相色谱法（HPLC对金银花中绿原酸的检测对金银花提取液中是否含有绿原酸进行定性分析，标准样品的色谱图如图4所示杵品则选取了70%乙醇提取液进行谱图绘制，如图5。根据图4、图5表明检测物均在10.211min处出现最大吸收峰，可以初步断定两种物质为同一化合物。绿原酸的标准曲线如图6所示。求得线性回归方程为Y=1.0066X108x+8530000,R2=0.9

21、985说明本方法在绿原酸的质量浓度为0.0050.025g/L时具有良好的线性。用不同工艺条件提取的待测液每次进样20仙测其峰面积以求出绿原酸含量结果如图7所示。从结果可以看出，紫外分光光度法测定的结果含量往往较高，重现性不好。而用高效液相色谱法测定的结果较稳定，偏差小。根据以上的不同检测结果可以看出，紫外分光光度法与高效液相色谱法得出的结果趋势一致，故在提取绿原酸时应选取70%乙醇作为提取溶剂，用HPLC测的绿原酸的提取率为85.63%。2.3 生物检测法测定金银花提取物的最低抑菌浓度(MIC本试验采用管碟法对不同提取工艺得到的金银花提取物和绿原酸标准品的最低抑菌浓度(MIC43的贷取司Hfti度量直分数为取一定量的溶植真空冷雄干燥i15CQ"炉丹T炭箱未以计W鬃.丁酸麻国提职助的在廿Bfc.S3用5/热不同工艺条件攫取摄朦屐含菱Fig,3Thegartofus«UVm反也arfferextfact：ngsctuwonaInInMnJM业离日河鲜格4*-i：r-:进行了测定，并设阴性对照与阳性对照（庆大霉素1.0g/L。结果如表1样品MIC（g/L水提取0.87060%乙醇提取0.90070%乙醇提取0.83580%乙醇提取1.000绿原酸标准样品1.110庆大霉素0.750不同工艺条件提取的绿原酸及绿原酸标准样品的最