分子生物学转录与转录后加工

1、会计学1分子生物学转录与转录后加工分子生物学转录与转录后加工第1页/共162页第2页/共162页transcription第3页/共162页第4页/共162页第5页/共162页Template(模板)第6页/共162页第7页/共162页（二）原核生物RNA聚合酶E.coli RNA聚合酶全酶 (holoenzyme)： 2 核心酶 (core enzyme)： 2DNA指导的RNA聚合酶DNA dependent RNA polymerase(DDRP)core enzyme细菌中单一类型的RNA聚合酶负责合成所有的RNA。第8页/共162页第9页/共162页亚亚基基基基因因分子分子量量(kD

2、)数数目目功能功能 rporpoA A40402 2 酶的装配酶的装配，与启动子上，与启动子上游元件及活化因子结合游元件及活化因子结合 rporpoB B1501501 1 结合底物，结合底物，催化磷酸二催化磷酸二脂键形成脂键形成 rporpoC C1601601 1结合结合DNADNA模板模板 rporpoD D32-32-90901 1 识别启动子，促进转录识别启动子，促进转录起始起始9 9未知未知第10页/共162页第11页/共162页第12页/共162页因子的结构70因子的一级结构第13页/共162页第14页/共162页因子与启动子的特异性相互作用第15页/共162页E.coli与枯草

3、杆菌各的因子同源区第16页/共162页第17页/共162页结合核心酶后第18页/共162页第19页/共162页（三）转录过程promoterterminatorStart point+10 +20downstream+1upstream-35 -10 1transcribed region第20页/共162页起始)第21页/共162页原核生物转录过程第22页/共162页启动子（promoter）：RNA聚合酶识别，结合并 开始转录的一段DNA序列。模板的识别第23页/共162页转录起始位点-35序列 -10序列TTGACA TATAAT五种不同启动子的共同顺序箭头表示突变，向上表示增加转录水平

4、，向下表示降低转录水平第24页/共162页提供RNA聚合酶识别信号有助于DNA局部双链解开第25页/共162页因子对RNA聚合酶与DNA结合的影响因子使RNA pol特异性的识别启动子第26页/共162页因子的更替可控制转录起始第27页/共162页第28页/共162页转录的起始第29页/共162页转录的延伸第30页/共162页第31页/共162页转录的终止终止子（ terminator ）：提供终止信号的DNA序列。第32页/共162页E.coli有两类不依赖因子的终止子: 依赖于因子的终止子第33页/共162页不依赖因子的终止子:具有茎环结构第34页/共162页有茎环结构，富含GC茎环结构后

5、有寡聚尿苷第35页/共162页第36页/共162页依赖因子的终止子（rho-dependent terminators ）第37页/共162页穷追(Hot pursuit)模型第38页/共162页制制通读第39页/共162页（四）真核生物转录特点真核DNAPAPBPC转录mRNAABC原核DNAABCP转录mRNA ABC第40页/共162页第41页/共162页第42页/共162页转录因子（transcription factors）Definition: 转录起始所需要的，而非RNA聚合酶本身组分的任何蛋白质第43页/共162页 Functions: Binding to DNA Recog

6、nizing another factor Recognizing RNA Pol Incorporating into initiation complex转录因子（transcription factors）第44页/共162页转录因子（transcription factors）Classification：普遍性转录因子：使RNA聚合酶结合到启动子上， 形成前起始复合物。其作用相对较弱，仅在 本底水平上支持转录并实施最小程度的调控。 又称通用因子转录调控因子：通过与启动子及增强子等调控元件结合 而调控转录活性的蛋白因子 包括上游因子和可诱导因子第45页/共162页是在所有启动子的RNA

7、 合成中都是必需的。是能够识别并结合转录起始位点上游的特异性短序列的DNA 结合蛋白。普遍存在，且活性不被调控。在特定的时间或特定的组织被激活或合成，能控制转录在特定的时间和地点进行的一类因子。通用因子(General factor)上游因子(Upstream factor)可诱导因子(Inducible factor)转录因子（transcription factors）第46页/共162页Definition: 指与基因 表达调控相关、能够被调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、增强子，负调控元件等第47页/共162页Definition: 指真核细胞内通过与顺式作用元件相

8、互作用而调节基因转录活性的蛋白质因子。第48页/共162页测定转录起点的方法（五）真核生物基因转录起始的几种研究方法第49页/共162页1. S1核酸酶图谱技术5 mRNA 33 5S1探针5 33 5S1核酸内切酶水解变性电泳第50页/共162页5 mRNA 33 5S1探针5 mRNA 33 5逆转录延伸引物变性电泳2. 引物延伸法第51页/共162页研究顺式作用元件结构的方法第52页/共162页A B切割位点A B核酸外切酶CA B连接接头A BCA B切割位点B和C报告基因连接报告基因载体转化E.coli分离质粒DNA分别转染培养细胞通过报告基因产物的活性，以检测基因活化与上游调控区片

9、段的关系第53页/共162页第54页/共162页接头扫描突变法机制第55页/共162页疱疹病毒胸苷激酶基因启动子的连接扫描突变第56页/共162页（六）真核生物RNA聚合酶对-鹅膏蕈碱的敏感性 酶的种类 中等敏感 RNA聚合酶III 敏感 RNA聚合酶II 不敏感 RNA聚合酶I 1.真核细胞的三类RNA聚合酶第57页/共162页-鹅膏蕈碱的结构鬼笔鹅膏菌是一种能产生-鹅膏蕈碱的毒磨第58页/共162页RNA聚合酶对-鹅膏蕈碱的敏感性第59页/共162页（核仁）（核质）U6snRNA, 7SLRNA, 7SKRNA第60页/共162页老鼠肝脏细胞三类RNA聚合酶在离子交换层析中的分离RNA聚合

10、酶I定位于核仁RNA聚合酶II和III定位于核质 第61页/共162页Eukaryotic RNA pol II has 10 subunits2.RNA聚合酶II第62页/共162页酵母RNA聚合酶II有12个亚基核心亚基： Rpb1、Rpb2和Rpb3共同亚基： Rpb5、6、8、12存在于所有三类RNA聚合酶中非必要亚基：Rpb4、7第63页/共162页RNA聚合酶II最大亚基的异质性nFunction: trigger initiation第64页/共162页老鼠浆细胞RNApol II部分亚基结构o、a、b是最大亚基的三种形式与酵母的RNA pol II的Rpb1相对应c是与酵母的R

11、pb2相对应第65页/共162页RNA pol II最大亚基不同形式间的相互关系IIa是CTD未被磷酸化的形式，主要负责转录的起始IIo是CTD被磷酸化的形式，主要负责转录的延伸IIb是被蛋白酶消化而失去CTD的形式第66页/共162页the crystal structure of RNA polymerase II from yeast 第67页/共162页（七）真核生物基因的启动子及转录起始复合物的组装类型I启动子类型II启动子类型III启动子第68页/共162页类型II启动子基本启动子(basal promotor)转录起始位点(initiation site, Inr)上游元件(up

12、stream elements)下游元件(downstream elements)核心启动子(core promotor)启动子近侧序列元件上游元件下游元件第69页/共162页作用是确定精确的转录起始位点，而不起调节转录效率的功能基本启动子(basal promotor)第70页/共162页上游元件(upstream elements)常表现出细胞类型特异性，功能主要是提高转录的效率和特异性第71页/共162页第72页/共162页转录起始位点(initiation site, Inr)第73页/共162页How does a pre-initiation complex form ?第74页/

13、共162页TF DTBP()（TATA框结合蛋白）TAF (TBP-associated factors)(TBP偶联因子) (8-10)X=A,B,D,E,F,H第75页/共162页formation of platform第76页/共162页第77页/共162页第78页/共162页Assembly of pre-initiation complex(PIC)转录前起始复合物第79页/共162页DABPolF复合物形成的模型聚合酶是结合在TFD，A和B结合位点（TATA box）下游的DNA上第80页/共162页RNA Pol is activated by CTD phosphorylat

14、ionCTD磷酸化后，使CTD中羟基电荷和结构发生变化，影响它与TBP结合的稳定性，使聚合酶从启动子上脱离第81页/共162页TFDTFFRNA PolTFHPiDNARNATFBTFA第82页/共162页通用转录因子参与转录起始、启动子清除、延伸的模型a.TBP或TFD，同B、F及聚合酶II形成最基本的起始复合物添加TFE和H，水解ATP使DNA在起始区解链，CTD部分磷酸化，产生流产转录物，很快停止。b. 随着ATP提供能量， TFH使DNA进一步解螺旋并使启动子清空c. CTD进一步磷酸化,NTP不断添加,延伸复合物不断进行RNA的延伸TBP和TFDB仍留在启动子上，延伸不需要TFE和H

15、，从延伸复合物解离下来第83页/共162页第84页/共162页来自克隆基因的产物的果蝇TFIID在体外整合的结构图第85页/共162页果蝇、人和酵母TAFs之间的关系第86页/共162页对缺乏TATA框启动子的起始第87页/共162页TBP与含有TATA框或不含TATA框的启动子的相互作用模型第88页/共162页第89页/共162页真核生物基因转录受激活因子增强的模型a.最小的TBP/TAF复合物不能支持激活b.两种不同的三聚体复合物支持Gal4-NTF1的激活作用，但不能支持Sp1的激活c.包含有TAFII-100的四聚体复合物能介导Sp1的激活作用d.完整的TFIID能支持各种激活因子的作

16、用TAFII介导各种激活因子的作用第90页/共162页类型I启动子上游控制元件(Upstream control element，UCE)核心启动子Core promoterPromoter第91页/共162页transcribed region+1-45 +20Core promoterUCE-180 -107第92页/共162页Core promoterUCErRNA的两个元件Tjian及其同事用接头分区突变法研究人类rRNA基因，结果显示UCE是最佳转录所必需的，但本底水平的转录不一定需要UCE的参与，而核心元件是转录所必需的第93页/共162页Tjian及其同事用接头分区突变法研究人类

17、rRNA基因的UCE和核心元件间插入或缺失不同长度的DNA序列，证实两个元件间的距离对转录起始也是非常重要的。两者之间插入或缺失碱基对，启动子强度将减弱，而且缺失比插入更敏感。rRNA的两个元件间的距离对启动子强度的影响第94页/共162页UBFSL-1 (Trans-factors第95页/共162页RNA聚合酶I的转录起始复合物第96页/共162页第97页/共162页UCECore promoterUBFUBFRNA POLTAFITAFITAFITBPRNA聚合酶I的转录起始复合物的装配第98页/共162页类型III启动子基因内启动子：基因外启动子:基因内I型启动子：由被中间元件分开的A

18、盒和C盒组成5S rRNA基因基因内II型启动子：由被中间元件分开的A盒和B盒组成tRNA基因U6 snRNA基因，7SKRNA基因类似类型II启动子，有TATA框，能与含TBP的转录因子结合混合启动子：海胆硒代半胱氨酸tRNA(ser)sec基因第99页/共162页Three types of promoters for RNA polymerase III第100页/共162页By deletionInternal promoter of 5s rRNA gene: +55+80第101页/共162页3端序列缺失对5SrRNA基因转录的影响a.Brown及同事对爪蟾5SrRNA基因3端序列

19、进行缺失，于体外进行转录。3端序列缺失但没越过启动子序列，仍能转录，只是产物比全长rRNA短，转录事件的发生表明启动子是完整的， 3端序列缺失到启动子序列，转录终止b.只有当3端序列缺失延伸到80位时，才无转录产物的合成第102页/共162页transcription factors for RNA Pol Initiation factors Assembly factorsTFBTFATFCTBP 2 pr第103页/共162页RNA pol 的转录起始复合物的装配tRNA基因内启动子第104页/共162页Factor ComponentsFunctionsRNA PolSL1TBP &a

20、mp; 3 pr本身不结合本身不结合DNA，使使RNA pol 正正确定位于起确定位于起始位点始位点TFBTBP & 2 prTF DTBP &10-12 pr特异性地结特异性地结合合TATA box第105页/共162页转录起始的一般规律第106页/共162页3种聚合酶对不含TATA box的启动子起始前复合物的识别模型在I,II,III类启动子上，最先结合的组装因子分别是UBF，SP1，TFIIIC，随后结合含TBP的另一因子分别是SL1，TFIID和TFIIIB。对I,III类启动子而言足以结合聚合酶起始转录，但II类启动子还需要更多的通用因子参与转录。第107页/共16

21、2页第108页/共162页post- transcriptional processing第109页/共162页第110页/共162页（一） rRNA前体的加工原核细胞有3种rRNA ：16S、23S和5SrRNA真核细胞有4种rRNA：28S、18S、5.8S和5SrRNA第111页/共162页三种rRNA是一个转录单位，一起转录的原核生物RNase EE三种rRNA是一个转录单位，一起转录的第112页/共162页真核生物第113页/共162页第114页/共162页40S亚基60S亚基第115页/共162页n核苷酸的修饰核苷酸的修饰（二） tRNA前体的加工原核生物第116页/共162页tR

22、NA核苷酰转移酶CTP、 ATP3端加上-CCA-OH第117页/共162页核苷酸的修饰（1）（1）（3）（2）（4）（2）还原反应 如：U DHU（3）核苷内的转位反应 如：U （4）脱氨反应 如：A I第118页/共162页n:ATP。核tRNA的酶促拼接第119页/共162页第120页/共162页真核生物第121页/共162页（三） mRNA前体的加工原核生物第122页/共162页真核生物第123页/共162页mRNA前体的剪接信号第124页/共162页鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后加工鸡卵清蛋白基因5端加帽子3端加尾剪接（splicing） 成熟的mRNA第125页/共162页（四）

23、RNA的自我剪接(Self-splicing )型内含子（ group intron ）的自我剪接型内含子（ group intron ）的自我剪接第126页/共162页型内含子的自我剪接第127页/共162页Group The structure of group introns第128页/共162页型内含子的自我剪接O P5POH3O PHO A2外显子I外显子IIP O AOHOH5POH3O PP O AO5POH3P第129页/共162页活性中心型内含子的二级结构及活性中心第130页/共162页Splicing releases mitochondrial group II intr

24、ons in the form of lariats(套索结构). 第131页/共162页Definition: 泛指具有催化功能的RNA的分子核酶（ribozyme）第132页/共162页（五） 真核mRNA前体的剪接第133页/共162页第134页/共162页snRNAsproteinssnRNA: small nuclear RNA(核内小分子RNA)snRNP: small nuclear ribonucleoprotein(小分子核内核糖核蛋白):U1、U2、U4、U5、U6 snRNAsnRNPshnRNAsOther proteins第135页/共162页Spliceosomes

25、 are ellipsoidal(椭圆形) particles with several discrete regions. 第136页/共162页Pre-mRNAGroup 第137页/共162页Mechanism of splicing第138页/共162页第139页/共162页第140页/共162页酵母细胞中5剪接位点与U6 snRNA相互作用模型第141页/共162页（六） 真核mRNA前体的选择性剪接（alternative splicing）Definition: 一个基因的初始转录产物在不同的分化细胞、不同的发育阶段、甚至不同的生理状态下通过不同的剪接方式，可以得到不同成熟mRN

26、A和蛋白质产物第142页/共162页选择性剪接的类型外显子内含子第143页/共162页1.剪接缺失外显子2.剪接保留内含子第144页/共162页3. 外显子中存在剪接点（部分缺失外显子）4. 内含子中存在剪接点（部分保留内含子）第145页/共162页小鼠免疫球蛋白重链基因的选择性剪接例：第146页/共162页（七） RNA的编辑Definition: RNA分子上的一种转录后修饰现象包括插入、缺失或核苷酸的替换第147页/共162页Example: 核苷酸替换人载脂蛋白B（ApoB）的mRNA外显子26ApoB基因CAATAAApoBmRNA5CAAUAA3肝细胞5UAAUAA3肠上皮细胞蛋白质ApoB100ApoB48第148页/共162页本章总结第149页/共162页n起始起始n延伸延伸n终止：终止：不依赖不依赖因子的终止子、依赖于因子的终止子、依赖于因子的终止子因子的终止子转 录第150页/共162页nIII转 录总结3种类型启动子及转录起始复合物的组装有哪些规律第151页/共162页第152页/共1