仪器分析_高效液相色谱法

1、1第三章 高效液相色谱法(HPLC)High Performance Liquid Chromatography2345 高效液相色谱法是继气相色谱之后，高效液相色谱法是继气相色谱之后，7070年代年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术. .3- 1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述一、定义一、定义 以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。色谱柱的色谱分析方法。二、二、HPLC特点特点1、高压、高压 经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，

2、所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法中，色谱法中，流动相改为高压输送流动相改为高压输送（150350 105 Pa ，最高输送压力可达最高输送压力可达450 105 Pa）;6 2、高速、高速 由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几 min、十几十几min可完成一个分析任务。可完成一个分析任务。 HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔每米塔板数可达几万或几十万板数可达几万或几十

3、万）。）。3、高效、高效 利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。 紫外检测器紫外检测器 10-9g 荧光检测器荧光检测器 10-11g4、高灵敏度、高灵敏度7高效液相色谱高效液相色谱8三三 、液相色谱分离原理及分类、液相色谱分离原理及分类 液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。为。 根据分离机制不同，液相色谱可分为：根据分离机制不同，

4、液相色谱可分为：液固液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。9四、液相色谱与气相色谱的比较四、液相色谱与气相色谱的比较1、相同点相同点（1）基本原理一致：）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同不同组分在两相中的作用力不同。（2）基本概念一致：）基本概念一致： 基本概念基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。离度、选择性等与气相色谱一致。（3）基本理论一致：）基本理论一致： 塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致塔板理论

5、与速率方程也与气相色谱基本一致。102、不同点不同点 由于在液相色谱中以由于在液相色谱中以液体液体代替气相色谱中的代替气相色谱中的气体气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：两种方法也有不同之处：（1）仪器设备和操作条件仪器设备和操作条件不同；不同；（2）应用范围应用范围不同；不同；11 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较定化合物、离

6、子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。使其应用受到一定程度的限制为困难。使其应用受到一定程度的限制，据统计只据统计只有大约有大约20%的有机物能用气相色谱分析的有机物能用气相色谱分析； 而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有占有机物的机物的70 80%。 12 （3）液相色谱分离能力比气相色谱液相色谱分离能力比气相色谱更强更强 因为：因为：气相色谱的流动相载

7、气是色谱惰性的，气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用（只能选择分子只与固定相相互作用（只能选择固定相固定相）。）。 而而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品组分分子，为提高选择性增加了一个因素品组分分子，为提高选择性增加了一个因素。还可还可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性（能同时选择增大分离的选择性（能同时选择固定相和流动相固定相和流动相） 。13液相色谱固定相类型多

8、液相色谱固定相类型多, ,如如离子交换色谱和排阻色离子交换色谱和排阻色 谱等谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不 可能的。可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。有利于色谱分离条件的选择。（4 4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容 易，而且回收是定量的，易，而且回收是定量的，可以做成制备色谱。可以做成制备色谱。（5 5）液相色谱尚缺乏）液相色谱尚缺乏通用的检测器通用的检测器，仪器比较复，仪器比较复 杂，杂，价格昂贵价格昂

9、贵。在实际应用中，这两种色谱。在实际应用中，这两种色谱 技术是互相补充的。技术是互相补充的。14 综上所述，高效液相色谱法具有综上所述，高效液相色谱法具有高柱高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。重复性好、应用范围广等优点。该法已该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。农业等科学领域获得广泛的应用。153- 2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（液相色谱速率理论液相色谱速率

10、理论） 与气相色谱速率理论对照自学。与气相色谱速率理论对照自学。161. 3- 3、4、5 高效液相色谱的主要类型及分离原理高效液相色谱的主要类型及分离原理一、一、高效液相色谱法分类高效液相色谱法分类 根据分离机理的不同，根据分离机理的不同，HPLC可分为以下类型：可分为以下类型：1、吸附色谱（液吸附色谱（液- -固吸附色谱）固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5 510m10m的硅胶吸附的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2 2、分配色谱（液、

11、分配色谱（液- -液分配色谱）液分配色谱）：早期通过在载体上涂渍：早期通过在载体上涂渍一薄层固定液制备固定相一薄层固定液制备固定相, , 现多为化学键合固定相，即用现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。173.3.离子交换色谱：离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.4.离子对色谱法：离子对色谱法：将一种

12、（或数种）与溶质离子电荷相将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。留行为的一种色谱法。185.5.离子色谱法离子色谱法：用离子交换树脂为固定相，电解质溶：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器检测组分含量，用抑制柱液为流动相，以电导检测器检测组分含量，用抑制柱消除强电解质背景离子对电导检测器的干扰。（与消除强电解质背景离子对电导检测器的干扰。（与离离子交换色谱法子交换色谱

13、法不同的是分离组分的检测器不同）不同的是分离组分的检测器不同）6.6.凝胶色谱（空间排阻色谱）凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝胶是：以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。19二、液一液分配色谱法（二、液一液分配色谱法（LLPC） 在液在液- -液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用适用于各种样品类型的分离和分析于

14、各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的、，无论是极性的和非极性的、水溶性和油溶性的、离子型的和非离子型的化合物。水溶性和油溶性的、离子型的和非离子型的化合物。1 1分离原理分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，进行，造成各组分

15、的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。从而能分离各种复杂组分。 20(1)(1)担体担体( (表面多孔型表面多孔型) ) 它是它是303040m40m的玻璃微球，表面附着一层厚度的玻璃微球，表面附着一层厚度为为1 1 2m 2m的多孔硅胶。由于固定相仅是表面很薄的多孔硅胶。由于固定相仅是表面很薄一层，因此，传质速度快，加之是直径很小的均匀球一层，因此，传质速度快，加之是直径很小的均匀球体，装填容易，重现性好，现已体，装填容易，重现性好，现已广泛使用广泛使用！ 但表面积小，柱容量低，需用高灵敏度检测器但表面积小，柱容量低，需用高灵敏度检测器。2、固定相、固定相21 由于液液色谱中由

16、于液液色谱中流动相流动相参与选择竞争，因此，参与选择竞争，因此，对固定液选择较简单，只需使用几种极性不同的固对固定液选择较简单，只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。定液即可解决分离问题。 （2）固定液）固定液 A 强极性固定液强极性固定液，一氧二丙腈一氧二丙腈 B 中等极性的中等极性的聚乙二醇聚乙二醇 C 非极性的非极性的角鲨烷角鲨烷等。等。22 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了了化学键合固定相化学键合固定相。 它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法，它代替了固定液的机械涂渍

17、，载体表面的一种方法，它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个革命性突破可以认为它的出现是液相色谱法的一个革命性突破。 是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有约有3/43/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。行的。（4）化学键合固定相（）化学键合固定相（CBPC）23 A 原理：原理：利用化学反应，使硅胶表面的硅羟基与利用化学反应，使硅胶表面的硅羟基与 各种固定液有机物或有机硅化合物反有各种固定液有

18、机物或有机硅化合物反有 应，将固定相与载体之间形成化学键，应，将固定相与载体之间形成化学键， 采用化学键合相的液相色谱称化学键合采用化学键合相的液相色谱称化学键合 相色相色 谱法。谱法。 由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于适用于梯度淋洗梯度淋洗，特别适用于分离容量因子，特别适用于分离容量因子k k值范围值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。24B 化学键合类型化学键合类型（1）硅酸酯型键合相）硅酸酯型

19、键合相SiORSi+HO ROH150 38 h（2）硅氮型键合相）硅氮型键合相SiOHSOCl2SiCl+ H2N (CH2)nXSiNH (CH2)nX25（3）硅）硅 碳型键合相碳型键合相+ RMgXSiOHSOCl2SiClSiR（4）硅氧烷型键合相）硅氧烷型键合相SiOHX：Cl, OCH3, OC2H5 等等+SiR3R1R2XSiOSiR3R1R226C 常见的化学键合固定相常见的化学键合固定相（1）非极性键合相）非极性键合相（反相键合相色谱法）反相键合相色谱法） 此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅硅胶胶C18H37（ODS，C

20、18）、硅胶硅胶苯基苯基等；流动相是采等；流动相是采用极性较强的溶剂，如用极性较强的溶剂，如甲醇甲醇水、乙腈一水、水和无机盐水、乙腈一水、水和无机盐的缓冲溶液等，由于流动相极性大于固定相极性，称的缓冲溶液等，由于流动相极性大于固定相极性，称反相反相健合相色谱法健合相色谱法。27A 它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；它多用于分离多环芳烃等低极性化合物；B 采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；于分离极性化合物；C 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解

21、的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等。 反相键合相色谱法具反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。优点。（2）极性键合相）极性键合相（正相键合相色谱法）正相键合相色谱法） 以极性的有机基团，以极性的有机基团，CN、NH2、双羟基等键合在硅、双羟基等键合在硅胶表面作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃胶表面作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化合物。此时，流动相，分离极性化合物。此时，组分的分配比组分

22、的分配比k值随值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。28 这种色谱方法主要用于分离异构体、极性这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。物。（3）离子型）离子型键合相色谱法键合相色谱法 以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如各种离子交换基团，如SO3H、CH2NH2、COOH等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；等时，就形成了离子性键合相色谱的固定相；流动相一般采用缓冲溶液。其流动相一

23、般采用缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱分离原理与离子交换色谱类同。类同。29 3、流动相、流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度流动相和固定相的极性程度。正相分配色谱正相分配色谱: : 适用于极性化合物的分离，其适用于极性化合物的分离，其流出顺流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。序是极性小的先流出，极性大的后流出。反相分

24、配色谱反相分配色谱： 适用于非极性化合物的分离，其适用于非极性化合物的分离，其流出流出顺序与正相色谱恰好相反。顺序与正相色谱恰好相反。30三、液一固吸附色谱法三、液一固吸附色谱法(LSAC) 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。相上的吸附作用不同来进行分离的。1、分离原理、分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面当流动相通过固定相（吸

25、附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，与流动相溶剂分子（）被流动相带入柱内，与流动相溶剂分子（S）在）在固定相表面发生竞争吸附固定相表面发生竞争吸附: X + n S吸附吸附= X吸附吸附 + nS31 其中其中K为吸附平衡常数为吸附平衡常数，K值大表示组分在吸值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。附剂上保留强，难于洗脱。K值小值小,则保留值弱，易则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。于洗脱。试样中各组分据此得以分离。K值可通过值可通过吸附等温线数据求出。吸附等温线数据求出。 nnSX

26、SXK吸附吸附达平衡时，有：达平衡时，有：32 2、固定相、固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不同的吸附剂，如同的吸附剂，如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。等。等。由于硅胶的优点较多，因此，以硅胶用得最多。等。由于硅胶的优点较多，因此，以硅胶用得最多。 目前最广泛使用的还是目前最广泛使用的还是表面多孔型微粒填料。表面多孔型微粒填料。 它由直径为它由直径为510 m的吸附剂微粒凝聚而成。的吸附剂微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细，传质速率快，易实现高效、这类固定相由于颗粒很细，传质速率快，易实现高效、高速。特别高速

27、。特别适合复杂混合物分离及痕量分析适合复杂混合物分离及痕量分析。33 一般把液一般把液- -固吸附色谱中流动相称作固吸附色谱中流动相称作洗脱剂洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。3、流动相、流动相34 四、四、离子交换色谱法（离子交换色谱法（IEC） 利用利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用

28、离子交换色谱法进行分中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。因此，应用范围较广。 1、离子交换原理、离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相离子交换剂交换能力的差别来实现分离的。离子交换剂交换能力的差别来实现分离的。35Ca2+Na+ 固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的固定的带电荷

29、基团带电荷基团和和可游离的平衡离子可游离的平衡离子。待分析物质电离后产。待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。2、离子交换固定相、离子交换固定相36阳离子交换：阳离子交换：HMSORMHSOR33ClXNRRXClNRR33阴离子交换：阴离子交换：一般形式：一般形式：ABRBAR离子交换反应：离子交换反应：37 固定相基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、固定相基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。纤维素和硅胶。 离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官

30、能基的离解度大小还有强弱之分（见下表）的离解度大小还有强弱之分（见下表）38 3、离子交换色谱流动相、离子交换色谱流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是离子交换色谱法所用流动相大都是一定一定pH和盐浓度和盐浓度（或离子强度）水的缓冲溶液。（或离子强度）水的缓冲溶液。 通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控值可控制制k值，改变选择性。值，改变选择性。 分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的过改变流动相的pH值来控制。增大值来控制。增大pH值会使酸的电离值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少

31、；降低度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。值，其结果相反。但无论属于哪种情况，但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的只要电离度增大，就会使样品的保留增大。保留增大。 39五、离子色谱法五、离子色谱法（IC） 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。离方法。1 1、离子交换色谱法对无机离子分离检测的困难、离子交换色谱法对无机离子分离检测的困难 在普通离子交换法中，对于那些不能采用紫外检测在普通离子交换法中，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测

32、离子的电导信号被强电解质流动相的导信号被强电解质流动相的高背景电导信号高背景电导信号掩没而无法掩没而无法检测检测，因而，离子交换色谱法在无机离子的分析和应用因而，离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。受到限制。40 为了解决这一问题，为了解决这一问题，1975年年Small等等人提出一种能同人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，。通过分离柱后的样品再经过抑制柱

33、，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相。使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相。2 2、离子色谱法原理、离子色谱法原理 以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，利用抑制柱消除流动相强电解质对测量影响，以电导检利用抑制柱消除流动相强电解质对测量影响，以电导检测器检测组分信号的色谱分析方法。测器检测组分信号的色谱分析方法。41 例如对于阴离子分析，色谱柱内为阴离子交换树例如对于阴离子分析，色谱柱内为阴离子交换树脂，在流动相中，待测阴离子（如脂，在流动相中，待测阴离子（如Br-）与阴离子交）与阴离子交换树脂上的换树脂上的OH-离子

34、交换：离子交换：OHNaBrRBrNaOHR交换交换洗脱过程为上述逆过程：洗脱过程为上述逆过程：BrNaOHROHNaBrR洗脱洗脱42 在阴离子分析中，最常见的洗脱液是在阴离子分析中，最常见的洗脱液是NaOH ，洗脱，洗脱过程中，过程中，OH-离子从分离柱的阴离子交换位置置换出待离子从分离柱的阴离子交换位置置换出待测阴离子测阴离子Br-。当待测阴离子从柱中被洗脱下来进入检。当待测阴离子从柱中被洗脱下来进入检测器电导池时，要求能检测出洗脱液中电导的改变。但测器电导池时，要求能检测出洗脱液中电导的改变。但洗脱液中洗脱液中OH-离子的浓度要比试样中阴离子浓度大得多离子的浓度要比试样中阴离子浓度大得

35、多才能使色谱柱正常工作。因此，与洗脱液的电导值相比，才能使色谱柱正常工作。因此，与洗脱液的电导值相比，由于试样离子进入洗脱液而引起的电导的改变非常小，由于试样离子进入洗脱液而引起的电导的改变非常小，因而，用电导检测器直接检测试样中离子的灵敏度极差。因而，用电导检测器直接检测试样中离子的灵敏度极差。43 若在色谱柱中，设立一个抑制柱，若在色谱柱中，设立一个抑制柱，抑制柱中装填抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相。成低背

36、景电导的流动相。 上例分析中，若使分离后的洗脱液通过填充有高容上例分析中，若使分离后的洗脱液通过填充有高容量量H+型阳离子交换树脂的抑制柱，则在抑制柱将发生型阳离子交换树脂的抑制柱，则在抑制柱将发生如下反应：如下反应：OHNaROHNaHR2BrHNaRBrNaHR44 可见，从抑制柱中流出的洗脱液中，洗脱液（可见，从抑制柱中流出的洗脱液中，洗脱液（NaOH）已经变成电导很小的水，消除了本底的影响；试样阴离子已经变成电导很小的水，消除了本底的影响；试样阴离子则转变为相应的酸，由于则转变为相应的酸，由于H+的离子趟度很大，所以，大大的离子趟度很大，所以，大大提高了电导检测的灵敏度。提高了电导检测

37、的灵敏度。3、离子色谱法装置离子色谱法装置双柱型双柱型离子色谱法离子色谱法色谱柱色谱柱抑制柱抑制柱45464、离子色谱法优点离子色谱法优点（1 1）分析速度快）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2 2）分离能力高）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的）分离混合阴离子的最有效方法最有效方法双柱；双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250 mm),流动相：流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量，流量138

38、 mL/h。 七种阴离子在七种阴离子在20 min内基本上得到完全分离，内基本上得到完全分离，各组分含量在各组分含量在350 ppm。47六、离子对色谱法六、离子对色谱法（IPC） 离子对色谱法是离子对色谱法是离子对萃取技术与色谱法相结合的离子对萃取技术与色谱法相结合的产物产物。在在20世纪世纪70年代中期，年代中期，Schill等人首先提出离子等人首先提出离子对色谱法，后来，这种方法得到十分迅速的发展，是对色谱法，后来，这种方法得到十分迅速的发展，是分分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。离子对色谱法原理离子对色谱法原理 离子对色谱法是离子对色谱法是将

39、一种（或数种）与溶质将一种（或数种）与溶质（分析物（分析物）离子电荷相反的离子（称离子电荷相反的离子（称对离子对离子或或反离子反离子）加到流动相或）加到流动相或固定相中，固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，从而使其与溶质离子结合形成离子对化合物，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。控制溶质离子保留行为的一种色谱法。48离子对分配机理离子对分配机理： 离子对色谱的分离机理主要离子对色谱的分离机理主要是离子对分配机理是离子对分配机理;假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流动相为水溶液动相为水溶液;在流动相中加入一种电荷与待分离组

40、分离子在流动相中加入一种电荷与待分离组分离子X+带相反的带相反的对离子对离子Y-，则组分离子，则组分离子X+与对离子与对离子Y-首先形成离子对化合首先形成离子对化合物物X+ Y-，然后在固定相和流动相中分配：，然后在固定相和流动相中分配： 阴离子分析阴离子分析：烷基胺类烷基胺类，如氢氧化四丁基铵，如氢氧化四丁基铵， 氢氧化十六烷基三甲基铵；氢氧化十六烷基三甲基铵； 阳离子分析阳离子分析：烷基磺酸类烷基磺酸类，如已烷磺酸钠；，如已烷磺酸钠；对对离离子子49 由于由于离子对化合物离子对化合物X+ Y-具有疏水性，因而被非极具有疏水性，因而被非极性固定相提取性固定相提取。组分离子的性质不同，它与反离

41、子形成。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对疏水性质不同，离子对的能力大小不同以及形成的离子对疏水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理离子对色谱法分离的基本原理。水相水相水相水相YXXYK固定相YX50水相水相固定相YXYXKXY平衡常数平衡常数：组分的分配系数：组分的分配系数：水相水相固定相YKXYXKXYX 因此，组分的分配系数因此，组分的分配系数 KX与与 水相中对离子水相中对离子Y-的的浓度和平衡常数浓度和平衡常数KXY有关。有关

42、。51正相离子对色谱法正相离子对色谱法：极性疏水性固定相，非极性流动相；：极性疏水性固定相，非极性流动相；反相离子对色谱法反相离子对色谱法：这种色谱法的这种色谱法的固定相采用非极性的固定相采用非极性的疏水性化学键合固定相疏水性化学键合固定相如十八烷基键合相（如十八烷基键合相（ODSODS）等，等，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。（如甲醇一水或乙睛一水）。 键合相反相离子对色谱法操作简便，键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流只要改变流动相的动相的pHpH值、平衡离子的浓度和种类，值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范

43、围就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛。问题。此法发展迅速，应用较广泛。52 七、凝胶色谱法七、凝胶色谱法（SEC）1 1、定义定义： 基于试样中组分分子的尺寸和形状不同来实现分离基于试样中组分分子的尺寸和形状不同来实现分离的色谱分析方法，称凝胶色谱法，又名的色谱分析方法，称凝胶色谱法，又名尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法，主要用于较大分子的分离。主要用于较大分子的分离。2、凝胶色谱凝胶色谱固定相固定相 按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中

44、通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。子小，故在最后出峰。53凝胶凝胶: : 指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。体。可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类：可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类：（1 1）软性凝胶）软性凝胶 具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，具有较小的交联结构，其

45、微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂适用以水溶性溶剂作流动作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。在高效液相色谱中。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶54（2）半刚性凝胶）半刚性凝胶 比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。 如高交联度的聚苯乙烯（如高交联度的聚苯乙烯（StyragelStyragel）（

46、3）刚性凝胶）刚性凝胶 溶胀性最差。它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶胀性最差。它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于制压强小于7MPa，流速，流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔径，；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。造成不良分离。 如多孔硅胶、多孔玻璃等。如多孔硅胶、多孔玻璃等。55A 凝胶色谱凝胶色谱谱所选用的流动相必须能溶解样品，同时谱所选用的流动相必须能溶解样品，同时必须必须能溶胀凝胶能溶胀凝胶。B 流动相的粘度要小。流动相的粘度要小。C 所选择的流动相还必须与检测器相匹配。所选择

47、的流动相还必须与检测器相匹配。D 以水溶液以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。3、凝胶色谱凝胶色谱流动相流动相 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。甲基酸胺和水等。56(1)(1)保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息；某些信息；(2) (2) 保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较 低的检测器

48、；低的检测器；(3) (3) 固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子 基本不保留分子，因此柱寿命长；基本不保留分子，因此柱寿命长；(4) (4) 不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量 差别必须大于差别必须大于1010才能得以分离。才能得以分离。4、凝胶色谱凝胶色谱的特点的特点 凝胶色谱凝胶色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：色谱所没有的特点：57 八、高效液

49、相色谱流动相八、高效液相色谱流动相一、一、流动相分类流动相分类 1 1、按组成不同可分为单组分和多组分；、按组成不同可分为单组分和多组分； 2 2、按极性可分为极性、弱极性、非极性；、按极性可分为极性、弱极性、非极性；二、二、常用溶剂常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。间。58 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲由于高效液相色

50、谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。流动相直接影响组分的分离度。（1 1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良 好的选择性。好的选择性。（2 2）溶剂要与检测器匹配。溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长截止波长要长。要长。所谓溶剂所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐

51、射产生强烈吸收剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶的，它严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。剂的紫外截止波长。三、三、对流动相溶剂的要求：对流动相溶剂的要求：59（3）纯度要高纯度要高。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生产生“伪峰伪峰”。60（4 4）化学稳定性好化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。溶剂。（

52、5 5）粘度要低粘度要低。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。 613 36 6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪贮液器贮液器高压泵高压泵检测器检测器梯度洗梯度洗脱装置脱装置色谱柱色谱柱压力表压力表进样器进样器馏分馏分收集器收集器五大部分五大部分：高压输液系统、进样系统、分离系统、：高压输液系

53、统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理与输出系统。检测系统、数据处理与输出系统。一、仪器基本组成一、仪器基本组成62 工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。来，由此得到液相色

54、谱图。 63二、各部分功能简介二、各部分功能简介1 1、高压输液系统、高压输液系统 包括包括溶剂贮存器溶剂贮存器、高压输液泵高压输液泵、梯度洗脱装置梯度洗脱装置和和压力表压力表等组成。等组成。（1）溶剂贮存器：溶剂贮存器：由玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯由玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯 塑料等制成容量塑料等制成容量12 L L容器，用于贮存足够容器，用于贮存足够 数量、符合要求的流动相。数量、符合要求的流动相。溶剂使用前要过滤和脱气溶剂使用前要过滤和脱气溶剂脱气方法溶剂脱气方法抽真空脱气法、吹氢脱气法抽真空脱气法、吹氢脱气法超声波脱气法超声波脱气法 加热脱气法加热脱气法64 B B 对高压输液泵的要求对高

55、压输液泵的要求：（2）高压输液泵高压输液泵A 作用作用：将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续：将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续 不断地送入流路系统，它是不断地送入流路系统，它是HPLC的关键的关键 部件，要求部件，要求压力：压力：150450105 Pa。 。输出压力高输出压力高:（150500）105 Pa； 流量范围宽流量范围宽: 0.1 10 mL/min 内连续可调；内连续可调； 流量恒定，无脉冲流量恒定，无脉冲； 流量精度和重复性好（流量精度和重复性好（0.5%以内）以内）；耐腐蚀、密封性能好耐腐蚀、密封性能好。65恒流泵恒流泵：在一定操作条件下，：在一定操作条件下，输出流动相流

56、量保输出流动相流量保 持恒定，持恒定，而与色谱柱引起阻力变化无关；而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵恒压泵：能保持：能保持输出压力恒定，输出压力恒定，但其流量则随色但其流量则随色 谱系统阻力而变化，故保留时间的重现谱系统阻力而变化，故保留时间的重现 性差。性差。 它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍使用较普遍恒流泵分恒流泵分机械注射泵机械注射泵和和机械往复泵机械往复泵两种。两种。C 高压输液泵类别高压输液泵类别6667 2、进样系统进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5 530 30 cmcm）

57、，所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。 柱外展宽柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。进样系进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样技术要求较严。 （1 1）组成：进样口，注射器，进样阀等。）组成：进样口，注射器，进样阀等。（2 2）作用：把分析样品快速、有效地送入色谱柱内。）作用：把分析样品快速、有效地送入色谱柱内。（3 3）要求：为获

58、得良好分离效果及分析重现性，需将样）要求：为获得良好分离效果及分析重现性，需将样 品品“浓缩地浓缩地”瞬间注射到色谱柱顶端瞬间注射到色谱柱顶端, , 成为一个成为一个样样点点。68准备状态准备状态进样状态进样状态流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品出口样品出口样品入口样品入口流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品环样品环（4）六通阀进样装置工作示意图69703、分离系统、分离系统色谱柱色谱柱（1 1）组成组成：色谱柱（包括固定相）、柱温控制箱、：色谱柱（包括固定相）、柱温控制箱、 连接管。连接管。（2 2）作用作用：使被分析物质在色谱柱内分离。：使被分析物质在色谱柱内分离。（3）

59、色谱柱色谱柱标准柱型标准柱型：内径：内径 4.6mm4.6mm，长度，长度1515或或25 cm25 cm，柱管材柱管材料有不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他料有不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属。填料颗粒度：填料颗粒度：510 m 。7172A A 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。防止堵塞。B B 更换流动相要渐变。更换流动相要渐变。C C 用后要清洗。用后要清洗。D D 不用时要保存好。不用时要保存好。（4）使用色谱柱注意事项：）使用色谱柱注意事项：73 4 4、检测系统、检测系统（1 1）作用：）作用：将色谱柱流出组分进行检测

60、，并将浓将色谱柱流出组分进行检测，并将浓 度或质量信号转变成电信号输出。度或质量信号转变成电信号输出。（2 2）要求：）要求：A 灵敏度高；灵敏度高； B 稳定性好；稳定性好； C 线性范围宽；线性范围宽； D 死体积小；死体积小； E 对流动相对流动相流量变化不敏感。流量变化不敏感。 74 是是HPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。比尔定律。A 紫外光度检测器紫外光度检测器（UV） 优点优点：