选修三_基因工程的基本操作程序(讲课用)

1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序有了目的基因，我们才有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。 才能确定目的基因是否才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。遗传和正确表达。一

2、、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成请阅读请阅读P8P8、9 9第一和二两段第一和二两段一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取1.1.基因文库：基因文库：概念见概念见P9P92.2.基因文库的分类基因文库的分类: :按外源按外源DNADN

3、A片段的来源分类片段的来源分类种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文库文库3.3.基因文库的目的基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。目的基因。4.4.获取目的基因的根据：获取目的基因的根据： 见课本见课本P95.5.基因文库的构建方法之一基因文库的构建方法之一（1 1）直接分离法）直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割

4、限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解5.5.基因文库的构建方法之基因文库的构建方法之mRNA与载体连与载体连接导入受接导入受体菌群体菌群逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA(cDNA)该生物该生物cDNA文库文库基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较1 1、 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技

5、术 通过这项技术可在通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外体外DNADNA扩增技术。扩增技术。聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段2 2、原理：、原理： DNADNA复制复制二、利用二、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP) 一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) MgMg2+2+( (激活剂激活剂

6、) )缓冲溶液缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物根据这一序列合成引物5 5/ /3 3/ /GGGGTCTC3 3/ /5 5/ /GAGACCCC5 5/ /3 3/ /引物引物GGGG变性变性复性复性延伸延伸1.变性变性(90-95度度)：目的基因：目的基因DNA受热变性，解链为单链；受热变性，解链为单链；2.复性（复性（55-60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3.延伸（延伸（70-75）：在

7、）：在DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）作用下，从酶）作用下，从5端端3端端进行延伸。进行延伸。5 5/ /3 3/ /AGAG引物引物5、扩增过程、扩增过程2 2、具体过程、具体过程PCR(多聚酶链式反应) 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物

8、一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的

9、作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基

10、因1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心质粒质粒DNADNA分子分子一

11、个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 2 2、基因表达载体的组成

12、：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受

13、体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动

14、子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持

15、_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。过程：过程：优点优点（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序

16、：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入

17、了目上是否插入了目的基因的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记,以此做探以此做探针针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带若显示出杂交带,表明染色表明染色体已插入染色体体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:归纳步骤DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两

18、个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子

19、杂杂 交交方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程: 用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA综上，目的基因的检测与鉴定综上，目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功分子水平分子水平检测检测个体水平个体水平鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴

20、定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交小结: 基因工程的基本操作程序n 获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成n 构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因n 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法n 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：练习练习1：

21、(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”）aa练习练习2：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备

22、加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。水稻新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法有农杆菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用利用 技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是 和和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的 作探针进行作探针进行分子杂交检测，又要用分子杂交

23、检测，又要用 方方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养植物组织培养脱分化和再分化脱分化和再分化耐盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌 (2) 动植物细胞动植物细胞 除去内含子除去内含子(3) 3 运载体自连、目的基因片段自连、运载体与目的基因片运载体自连、目的基因片段自连、运载体与目的基因片段相连的环状段相连的环状DNA分子分子 。(1) 信使信使RNA(mRNA) 逆转录逆转录(反转录反转录) 双链双链DNA(目的基因目的基因) （0606年江苏卷）基因工程又叫基因拼接技术。年江苏卷）基因工

24、程又叫基因拼接技术。（1 1）在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径）在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的之一是：以目的基因转录的_为模板，为模板，_成互补成互补的单链的单链DNADNA，然后在酶的作用下合成，然后在酶的作用下合成_。 （2 2）基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、）基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、_。若将真核基因在原核细胞中表达，对该目。若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要求是的基因的基本要求是_。 （3 3）假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限）假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与

25、目的基因，将切割后的运载体制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入与目的基因片段混合，并加入DNADNA连接酶。连接产物至连接酶。连接产物至少有少有_种环状种环状DNADNA分子，它们分别是分子，它们分别是_。信使RNA逆转录 动植物细胞动植物细胞 除去内含子 3 运载体自连的、目的基因片段自连、运载体与目的基因片段相连的环状DNA分子 双链DNA（目的基因 知识点一：知识点一：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启

26、动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起聚合酶结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能片断，它能阻碍阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落) )不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信