叶绿素的测定(分光光度法)

1、xx行业标准xx的测定(分光光度法)SL881994DeterminationofchlorophyII(Spectrophotometricmethod)水利部19950501批准19950501实施1总则1.1 主题内容本标准规定了用分光光度法测定水体中的叶绿素。1.2 适用范围本标准适用于河流、湖泊、水库或池塘等水体中叶绿素的测定。1.3 干扰及消除1.3.1脱镁叶绿素a能够干扰叶绿素a的测定，当含有脱镁叶绿素时叶绿素a的测定值偏高。因此，在测定叶绿素a的时候，还要测定脱镁叶绿素a132脱镁叶绿素a对叶绿素a的干扰，可通过测定叶绿素a酸化前后产生的吸收峰之比，对表观叶绿素a的浓度作脱镁叶

2、绿素a的校正。2原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，收集植物性浮游生物，用90%的丙酮溶液提取。将提取液离心分离后，测定750、663、645、630nm的吸光度，计算叶绿素的浓度。3仪器3.1 分光光度计3.2 比色xx:10mm和50mm。3.3医用离心机。3.4离心管：1015mL带塞刻度管。3.5研钵:直径约80mm。3.6 过滤装置：过滤器，微孔滤膜（孔径0.45am，直径60mm），真空泵（吸气泵或蠕动泵）。3.7 常用实验设备。4 试剂4.1碳酸镁悬浮液：1%（m/V）。称取1.0g细粉末碳酸镁（MgCO3）悬浮于100mL蒸馏水中。每次使用时，要充分摇匀。4.2丙酮溶液：90%（

3、v/V）。在900mL丙酮中加100mL蒸馏水。4.3盐酸溶液：1mol/L。量取83mL盐酸（尸1.19g/mL）溶于水中，冷却并稀释至1000mL。5 样品的采集与保存5.1 样品应按浮游植物定量采样方法，采集在玻璃或聚乙烯瓶子里。河流、湖泊、水库取500mL，池塘取300mL。5.2 采样后，样品应放在荫凉处，避免日光直射，最好立即对水样进行分析处理。如需放置水样，则应避光冷藏保存（25C），而且每升水样需加1mL1%碳酸镁悬浮液，以防止酸化引起色素溶解。6 步骤6.1 浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm的微孔滤膜吸滤。过滤器内无水分后，还要继续

4、抽吸几分钟。如果要延时提取，可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。6.2提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入3mL丙酮溶液（4.2）至滤纸浸湿的程度，把滤膜研碎，再少量地加90%的丙酮溶液，把滤膜完全研碎，然后用90%丙酮溶液将已磨碎的滤膜和丙酮溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过6mL，盖上管塞，置于4C的暗处浸泡24ho6.3 离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量90%丙酮溶液于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复23次，直至沉淀不含色素为

5、止，最后将上清液定容至10mL。6.4测定：取上清液于10mm或50mm的比色池中，以90%丙酮溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630nm的吸光度。选择比色池的光程长度或稀释度，使其光密度OD663大于0.2，小于1.0。7 结果表示从各波长的吸光度中减去波长750nm的吸光度，作为已校正过的吸光度D,按下式计算叶绿素的浓度：8注意事项8.1 使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥、无酸,不要用酸浸泡或洗8.2750nm处的吸光度读数用来校正混浊度。由于在750nm的提取液的吸光度对丙酮与水之比的变化非常敏感，因此对于丙酮提取液的配制要严格遵守90份丙酮比10份水（体积比）的配比。8.3 使用斜头离心机时，容易产生二次悬浮沉淀物。为了减少这一困难，使用外旋式离心机头，在离心之前瞬间加入过量的碳酸镁。8.4 在研钵中用90%丙酮溶液提取叶绿素时，如果研磨操作进行不充分，就不能完全提取出来。也可以用外筒玻璃代替研钵，研棒用特氟隆制的匀化器。8.5因为叶绿素提取液对光敏感，故提取操作等要尽量在微弱的光照下进行。8.6吸收池事先要用90%丙酮溶液进