细胞毒性试验方案

1、细胞毒性实验设计方案1.胰酶双抗(青霉素/高DMEM(糖)链霉素)DAPI准备材料：MTT(5mg/mL)DMSOPBS4%指甲油6孔培养板多聚甲醛培养瓶(25mL)96孔培养板超薄载玻片一包0.45滤膜m以灭菌：50mL,10mL,5mL离心管两种枪头2.实验方案材料本实验所用的为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX),在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时SiO2-本实验的夹心二氧化硅中药物得以释放。目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅(，SiO2-SS-HASiO2-SS-HA/DOXSS-HA/DOX)的细胞毒性。实验组为、DOX成纤维细

2、胞为正常人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和分别采用，HepG2L929空白对照组为纯细胞细胞模型。SiO2-SS-HA/DOX、HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为采用1%（w/v）DOXSiO2-SS-HA、，空白对照组为纯细胞。10%（v/v）培养基中含有FBS和、。配制不同浓度的链霉素青霉素双抗（/）SiO2-SS-HA/DOXSiO2HA药物载、DOX体培养基溶液。HepG2以人肝癌细胞为肿瘤细胞模型（1）.12%DMEM87%1%血清培养基的配置：双抗具体操作步骤：细胞的复活：C温水中，使细胞快速溶解。将悬浮的细将冻存于液氮中的细胞取由，迅速放入37无血清培养基，5mL胞移至离心管中

3、，力口1000rmp,5min离心（每次转移时，将之前的离心管洗涤，5mL去上清，再加有血清培养基，转移至培养瓶中。并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。）将培养瓶放入培养箱中培养。细胞的传代：C,每次使用一管，避的胰酶分装至小离心管中，0.25%将，冻存于2mL每个管中-20免反复冻融。的酒精放入超净台。将培养液倒入废液75%将培养瓶从培养箱中取由，盖子旋紧，喷缸，操作完成后，残留培养基用吸管吸干净，培养瓶口-用火烧。加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min,于显微镜下观察细胞形态，呈2mL12%DMEM终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。圆形，即消化完毕，加入离心。迅速倒掉上清，加入10mL离心

4、管中，1000rmp,5min,将细胞悬浮液移入6mLDMEM培养基,分装至两个培养瓶中，再各加入培养箱中培养48h。，于37C,5%的CO22mLDMEM至5mL-。下一次传代步骤同:细胞存活率测定方法(布板，加样)。同传代步骤-并用移液枪来回吸，使液体混合均匀，将所有含给每个离心管中加入定量的培养基，有细胞的培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为30mL。个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含96孔板中每个浓度设计5细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空白调零孔，每孔加入，5%(v/v)CO2L含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定

5、的湿度，100222小时。温度保持在37C,培养微升的0.03g将谷胱甘肽加入到10mL培养基，充分溶解，浓度为0.003g/mL,取20.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培养基中，将这两个浓度含谷胱甘肽的培养基替换部分原来的培养基，作为对照，不需要加谷胱甘肽的孔换上5%(v/v)CO2,温新鲜培养基，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，小时，具体的加样孔见图一。2度保持在37C,培养的培养基中，分成两份，其中3mL样品溶到SiO2-SS-HA/DOX1.2mg将的的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，1.5mL一份里加入其中一份SiO2-SS-HA/DOX样新鲜培养基

6、，依此类推，便得到一个浓度梯度的加入1.5mL品。SiO2-SS-HA样品的浓度配制方法同上。的0.918mg将SiO2-SS-HA/DOX的培养基中，剩下3mL。所示。将孔板放入培养箱孔板中的培养基，如图961将配制好的载体溶液替换原来37,温度保持在C,培养5%(v/v)CO2中，培养箱保持一定的湿度，24小时。5mg/mL配制的溶液，将孔板中的培养更换成MTTMTT溶液，将孔板放-入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2，温度保持在37C。培养4小时后，mmus:.和*工»|kFLp-iF.)1AJK将孔板中的培养基取由，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100

7、以L的DMSO,溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为490nm图1药物载体布板示意图.以L929成纤维细胞为正常细胞模型实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX,空白对照组为纯细胞。实验目的为测定药物载体溶液对正常细胞的细胞毒性。培养基的配置：双抗1%血清12%DMEM87%具体操作步骤：细胞的复活：C温水中，使细胞快速溶解。将悬浮的细37将冻存于液氮中的细胞取由，迅速放入离心胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min（每次转移时，将之前的离心管洗涤，去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。）将培养瓶

8、放入培养箱中培养。细胞的传代：C,每次使用一管，避2mL,冻存于-20将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中免反复冻融。的酒精放入超净台。将培养液倒入废液将培养瓶从培养箱中取由，盖子旋紧，喷75%培养瓶口缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，用火烧。,于显微镜下观察细胞形态，呈圆形，即2-3min2mL加入胰酶将瓶底铺满，消化终止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。消化完毕，加入2mL12%DMEM离心。迅速倒掉上清，加入将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入6mLDMEM。48hCO25%375mL2mLDMEM,至，于C,的培养箱中

9、培养下一次传代步骤同-。细胞存活率测定方法（布板，加样）：同传代步骤-。并用移液枪来回吸，使液体混合均匀，将所有含给每个离心管中加入定量的培养基，离心管中，最终使液体体积为50mL12mL。有细胞的培养基转移到一个个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含孔板中每个浓度设计596细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空白调零孔，每孔加入，以1005%(v/v)CO2L含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，温度保持在3722C,培养小时。-将所有加样的孔换成新鲜培养基，作为与癌细胞的对照。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO

10、2,温度保持在37C,培养2小时。将0.4mg的SiO2-SS-HA/DOX样品溶到1mL的培养基中，分成两份，其中一份里加入0.5mL的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，其中一份加入0.5mL新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的SiO2-SS-HA/DOX样品。SiO2-SS-HA样品的浓度配制方法同上。1mL的培养基中，剩下的步骤同0.306mg的SiO2-SS-HA/DOX样品溶到将。o,所示。将孔板放入培养箱将配制好的载体溶液替换原来96孔板中的培养基，如图2,温度保持在37C,培养中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2小时。24溶液，将孔板放入培养箱中，MTT配制5mg/mL的溶液，将孔板中的培养更换成MTT小时后，将孔板中的培培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2，温度保持在37Co培养4,溶解孔中的甲瓒，采DMSO以L的3养基取由，用PBS溶液清洗次，然后向每孔加入100490nm用酶标仪测定，波长设定为二(ODtreated-ODblank/ODcontrol-:细胞存活率细胞存活