第三节(1) 多肽和蛋白质类药物的生产

1、第三节第三节 多肽及蛋白质类药物多肽及蛋白质类药物提取法生产胸腺素提取法生产胰岛素提取法生产胸腺素o1966年Goldstein等首次报道从小牛胸腺中提取了部分纯化的胸腺素，1972年进一步纯化分离得到一组具有免疫活性的多肽，称胸腺素F5（即从小牛胸腺提取得到的第5种组分），并可提供临床使用。o药理作用与临床作用 促进T淋巴细胞分化成熟。 （1）临床上主要用于治疗细胞免疫缺陷疾病细胞免疫缺陷疾病，如胸腺发育不良、重症联合性免疫缺陷症、多次感染综合症等； （2）肿瘤化疗和放疗并用胸腺素可使细胞免疫应肿瘤化疗和放疗并用胸腺素可使细胞免疫应答增强答增强，从而加强化疗和放疗的抗肿瘤效果。胸腺素具有增强

2、细胞免疫功能和调节免疫平衡等作用。用于治疗细胞免疫缺损性疾病，如胸腺发育不全、重症混合性免疫缺乏症、运动失调性毛细血管扩张症、麻风、重症感染、复发性口疮等伴有细胞免疫功能低下的患者。亦可用于病毒性肝炎、恶性肿瘤和抗衰老。 提取法生产胸腺素胸腺素的结构与性质o胸腺素是几十种多肽组成的混合物，相对分子量在1万以下；o等电点在3.59.5；为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较，根据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名，共分三个区域： 区：3.55.0 三个区域 区：5.07.0 区：7.09.5o胸腺素对热稳定，短时间内加热至80，其生物活性不降低。 提取法生产胸腺素提取工艺路线小牛胸腺

3、 预处理 去脂肪和结缔组织，绞碎 胸腺碎块 盐析 0.9%NaCl-0.5%辛醇 提取液 过滤 纱布过滤 上清液(F1) 上清液(F2) 除杂蛋白80，冷却上清液(F3) 25%硫酸铵沉淀(F4)盐析 25%硫酸铵上清液 除杂 溶解，离心洗脱液提取 Sephadex G-150色谱分离洗脱液G-25脱盐 胸腺素（胸腺素（F5）干燥 冷冻干燥提取法生产胸腺素工艺说明工艺过程a预处理：去脂肪，绞碎b提取：生理盐水（盐水溶液），匀浆，离心（组分1）c除杂蛋白：加热，60，离心（组分2）d纯化： 分段盐析 pH=7.0磷酸盐缓冲液，硫酸铵饱和度0.25，上清液（组分3） 调pH=4.0，硫酸铵饱和度0

4、.5，盐析物（组分4） 除杂 0.1M Tris-HCl缓冲液（pH=8.4）溶解，4000离心30min 色谱分离 凝胶层析Sephadex G-150柱，第3个峰（葡聚糖凝胶，分离范围5,000300,000） 脱盐 凝胶层析Sephadex G-25柱，第1个峰（分离范围10005000）e干燥：冷冻干燥（组分5） 提取法生产胸腺素工艺说明o工艺讨论（1）除加热步骤外，所有步骤应在04下进行。（2）组分4过Sephadex G-150柱时，在276nm波长检测共有4个吸收峰，胸腺素活性位于第3个峰。进一步Sephadex G-25柱脱盐，共有2个吸收峰，胸腺素活性位于第1个峰。1965年

5、9月17日，我国在世界上第一次人工合成了一种具有生物活性的结晶蛋白质胰岛素，从而表明我国在多肽和蛋白质合成方面的科学技术已在世界上居先进地位。这种胰岛素是经过几年的艰苦努力，由中科院生化所、有机化学所和北大化学系合作，在王应睐和汪猷领导下合成成功的。提取法生产胰岛素胰岛素的分子模型提取法生产胰岛素猪胰猪胰刨碎 胰片浓缩 乙醇,草酸提取液 碱化 氨水pH88.4碱化液酸化液酸化硫酸pH3.63.8浓缩液减压蒸发去脂溶液去脂 速热速冷盐析物盐析 NaCl,pH22.5滤液提取 水、丙酮,氨水pH4.24.3酸化沉淀氨水,乙酸锌,pH6 锌沉淀 胰岛素精品胰岛素精品 碱化 结晶 柠檬酸、乙酸锌、丙酮

6、，氨水, pH8,过滤调pH6结晶 洗涤 干燥水,丙酮、乙醚；真空干燥372h提取法生产胰岛素o工艺过程方法：酸醇法和锌沉淀法（1）提取：酸醇法（2）碱化、酸化：除碱性蛋白、酸性蛋白（3）浓缩：30以下，减压浓缩（4）去脂、盐析：去除脂类、分开杂蛋白（5）酸化、锌沉淀：除酸性蛋白（6）碱化、锌沉淀：除碱性蛋白（7）洗涤、干燥：胰岛素成品质量鉴定质量鉴定多肽和蛋白质含量测定多肽和蛋白质含量测定质量鉴定质量鉴定多肽和蛋白质含量测定多肽和蛋白质含量测定质量鉴定质量鉴定多肽和蛋白质纯度测定多肽和蛋白质纯度测定1、电泳均一性测定在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electrop

7、horesis）。电泳已日益广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。2、超速离心（ultracentrifugation） 在超速离心机中，应用强大的离心力分离、制备、分析物质的方法。超速离心机的离心速度为每分钟60000转或更多，离心力约为重力加速度的500000倍，可分成制备性超速离心机和分析性超速离心机两大类。两者均装有冷冻和真空系统。制备性超速离心机容量较大，主要用于分离制备线粒体、溶酶体和病毒等以及具有生物活性的核酸、酶等生物大分子。分析性超速离心机另装有光学系统，可以监测旋离过程中物质的沉降行为并能拍摄成照片。 质量鉴定质量鉴

8、定多肽和蛋白质纯度测定多肽和蛋白质纯度测定o要求： 1. 具有强烈的工作责任心和领悟力。 2. 生物、生化、医药、化工、生物技术相关专业，大专以上学历。 3. 制药行业质量保证岗位3年以上的工作经验。 4. 熟悉中国、WHO、美国和欧盟GMP及相关法规。 5. 了解生物制药的工艺、工程与质量检验。 6. 有起草制订质量保证体系文件与药厂GMP认证的经验。 7. 能熟练运用计算机和常用软件；英文熟练，包括听说读写。 人白蛋白人白蛋白: 目前人白蛋白的生产工艺为目前人白蛋白的生产工艺为“低温乙醇法低温乙醇法” 经不同浓度的乙醇反复沉淀所得，最终产品还须经经不同浓度的乙醇反复沉淀所得，最终产品还须经

9、60 10小时的专项病毒灭活，经验证该产品有小时的专项病毒灭活，经验证该产品有可靠的安全性，可靠的安全性， 国内外至今尚无使用该产品而感染国内外至今尚无使用该产品而感染HIV、HBV、HCV等报道。等报道。特性、结构和功能o特性白蛋白又称清蛋白，是人血浆中含量最多的蛋白质，约占血浆总蛋白的35%，人白蛋白 对人体无抗原性。人血丙种球蛋白，属于一类糖蛋白，也称为免疫球蛋白，主要存在于血浆中，具有抗体活性。免疫球蛋白占血浆总蛋白的20%。对酸较稳定，其耐热性要强于血浆中其他蛋白，在高温下，白蛋白容易发生聚合，氧化钠或脂肪酸盐可提高白蛋白的热稳定性结构o白蛋白为单链，含有575个氨基酸残基，相对分子

10、质量为65000，其N末端为天冬氨酸，C末端为亮氨酸，可溶于水和半饱和硫酸铵溶液，一般在60%的硫酸铵饱和度时析出沉淀。功能o在临床上，白蛋白主要用于维持血浆胶体渗透压，用于失血性休克、严重烧伤、低蛋白血症等；人丙种球蛋白则主要用于被动免疫，可预防流行性疾病，如病毒性肝炎、脊髓灰质炎、风疹、水痘和丙种球蛋白缺乏症。白蛋白制备工艺过程及控制要点o（1）将人血浆泵入不锈钢夹层反应釜内，开启搅拌，用Na2CO3，溶液调pH为8.6，再泵入等体积的2%利凡诺溶液，充分搅拌后静置24h，分离上清液（供生产丙种球蛋白用）与络合溶液。o（2）解离 溶液用无菌蒸馏水稀释，用稀盐酸调至弱酸性，加氯化钠0.15%0.2%，不断搅拌进行解离。充分解离后，加热至65维持1h，立即用冷水冷却。o（3）分离 冷却后，解离液用篮式离心机分离，离心液再用不锈钢压滤器过滤。o（4）超滤 上述过滤液用超滤机超滤浓缩。o（5）热处理 浓缩液在60恒温处理10h，灭火病毒。o（6）澄清和除菌 以不锈钢压滤器澄清过滤，再用微滤除菌。人血丙种球蛋白制备工艺过程及控制要点o（1）取白蛋白制备过程中络合后剩下的上清液，在不锈钢反应釜中进行搅拌，用1