第二章 荧光光谱与荧光信号采集处理

1、第二章 荧光光谱与荧光信号采集处理1.荧光的产生荧光（Fluorescence）： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时以光的形式释放出它所吸收的能量，这种光即称为光致发光： 利用光源激发而产生，荧光和磷光均为光致发光.共聚焦显微镜常涉及的光谱区域共聚焦显微镜常涉及的光谱区域激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光的一定波长范围内的光线称为该荧光的激发光。 激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)激发光谱： 又称荧光激发光谱，通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱。实质： 反映了不同波长激发光所激发出荧光的相对效率。发射光谱： 又

2、称荧光发射光谱，反映荧光物质的荧光发射强度与发射光波长之间相互关系的光谱曲线。受激光照射后所发出的荧光不是单一波长，而是由许多不同波长所组成的光谱曲线 实质： 反映了所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。二者关系: 物质发生电子从基态向激发态跃迁过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量，因此，荧光的波长要大于激发光的波长，两者的差值称为 Stokes shift（斯托克斯位移）。激发和发射之间存在着能量损失激发光谱和发射光谱的用途 是选择和使用荧光探针、鉴别不同荧光物质的依据 2.荧光的淬灭 由于各种原因，使荧光探针的荧光强度降低的现象称为荧光淬灭。 能引起荧光强度降低的物质称为淬灭剂。 荧光的

3、淬灭原因（内因与外因） 外因的影响因素：光照射最常见的因素，会引起碰撞淬灭荧光分子与外部分子形成非荧光的络合物共振能量的转移溶剂种类、pH值温度 光漂白光漂白如何避免：使用低强度激发光，尽量缩短采集时间；使用闪烁光源，避免一直激发使用一些有效的荧光保护剂，延缓荧光淬 灭时间。3.荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）。 荧光探针的发展非常迅速，目前仅美国 Molecular Probes公司就可提供1800多种荧光探 针，每年该公司还不断推出新的荧光探针。通 常每种被测物质都有几种或几十种特异的荧光 探针。 选择合适的荧光探针是有效

4、地进行实验并获取理想实验结果的保障。理想荧光探针的标准：准确真实地测出所需要检测的指标；不影响细胞固有的状态；尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。荧光探针的选择 已经商品化的荧光探针有数千种，可以根据自己研究课题的需要进行选择。 1.根据实验目的及所要检测的指标 实验中选择使用何种荧光探针是由实验目的决定的，如待测心肌细胞内的钙离子 选择范围就限定为标记活细胞钙离子的探针等。 Molecular Probes, Inc 商品探针价目Probes for ProteinsProbe Excitation EmissionFITC 488525PE 488575APC 630650PerC

5、P 488680Cascade Blue 360450Coumerin-phalloidin 350450Texas Red 610630Tetramethylrhodamine-amines 550575CY3 (indotrimethinecyanines) 540575CY5 (indopentamethinecyanines) 6406702. 考察荧光探针的特异性和毒性 考察的荧光特性包括：荧光探针与样品的反应性： 选择性或专一性； 探针的跨膜特性；如标记核的探针AO/ PI 反应条件（浓度、温度、pH值、作用时间、反应介质）； 荧光探针是否对样品有毒副作用等干扰。荧光强度应用细胞毒

6、性荧光强度应用细胞毒性PIViable Cell Damaged Cell PI：细胞核荧光染料 荧光探针的灵敏度及荧光强度 光吸收效率（摩尔消光系数）和荧光量子产率能反映探针灵敏度及强度。在选择时，尽量挑选这两个数值高的探针。 荧光探针标记后样品的光谱特性 了解探针的稳定性和光漂白性 对光照、荧光物质的浓度、探针所在的介质、温度的稳定性等。如光照下容易淬灭，注意避光浓度低，荧光强度低；浓度太高，荧光强度也下降 样品中 之间的相互影响 多重荧光用两种或两种以上荧光探针标记同一样品中不同成分或结构的方法。常用于分子的细胞内定位、检测荧光原位杂交信号、细胞凋亡、细胞融合、细胞外药物跨膜运转等。 样

7、品中多重荧光之间的相互影响主要表现为光谱交叉（窜色）。光谱交叉Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection两色以上荧光分析存在 光谱交叉荧光光谱拆分红色荧光显示微丝黄色显示微管兰色显示细胞核3.考察荧光探针与所用共聚焦系统的匹配情况 主要指：二者的激发波长要匹配；仪器的性能能否达到实验要求，如扫描速度能否检测到荧光信号的快速变化等。广谱性的荧光染料（探针） 苯胺蓝、焦宁Y（pyronin Y） 罗丹明B（rhodamine B） 荧光素（fl

8、uorescein） 曙红Y（eosin Y） 吖啶橙（acridine orange）专一性的荧光染料（探针） 核酸检测探针：DAPI、PI、YOYO、TOTO 肽和蛋白质检测探针：Fluorescamine，OPA， BCA method 酶检测探针：EnzChekTM 5Nucleotidaes Assay kit 细胞骨架探针：微管探针、微丝探针常用荧光探针举例1.标记细胞器的荧光探针1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子, 可检 测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留时间 短（慢反应线粒体膜电位探针） JC1 线粒体膜电位低时

9、为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电 位最佳探针Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 , 稳定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitotracker Orange 还原型, 只能染活细胞 2)溶酶体 Lysosome 中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器 官为非特异性3)内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网, 较低浓度

10、标记线粒体4)高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 5)细胞核PI propidiumiodide 536/617 DNA/RNA 死细胞EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活细胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞AO 500/526 DNA 活细胞 500/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死细胞SYTO1116 2024

11、488/ 520 活细胞SYTO1116 2024 521/ 556 活细胞SYTO 17 621/634 活细胞2. pH荧光探针SNAFL-calcein-AM：胞浆pH荧光探针，吸收波长为 506nm，发射波长为530nm、605nm； 适用于单激发双发射测量。BCECF-AM：胞浆pH荧光探针，吸收波长482nm,发 射波长520nmFITCdextran：通过胞饮作用进入溶酶体。适用于 pH值范围是46。3.常见膜电位荧光探针DiBAC4(3)膜电位慢反应荧光探针，吸收峰波长340nm，发射波长517nm，在生理液中带有负电荷。仅存在于细胞浆中，细胞核不会着色。原理：膜电位超级化使胞

12、浆中探针浓度增加，二聚体增多，荧光强度降低；膜电位去极化时探针排出，胞浆内单体增加，荧光强度增加。Rhodamine123慢反应线粒体膜电位探针，吸收峰波长为505nm，发射峰波长534nm。染色后胞浆和线粒体中均有荧光探针。根据实验记录的细胞荧光图像。圈定粒体区域和胞浆区域计算平均荧光强度。4.膜磷脂流动性NBD-C6-HPC为磷脂特异性荧光标记探针。吸收波长为466nm，发射波长531nm。 这种探针的荧光在强光源照射下会产生光漂白效应，可用荧光漂白后重恢复技术（Fluorescence Recovery After Photobleaching,FRAP）测量膜磷脂的流动性。FRAP：借

13、助高强度、脉冲式激光照射细胞的某一区域，从而造成该区域荧光分子的淬灭，通过低强度激光扫描，可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向照射区域扩散的速率。观察荧光分子在活细胞中的流动荧光恢复漂白脂膜流动性的测试原理 4.荧光图像的采集、处理与定量测定4.1 采集的图像类型与处理 采集的图像分为两种: 荧光图像 光学图像。可实现如下图像采集功能： 1) 单独采集荧光或光学图像; 2) 分通道同时采集多重荧光图像和透射光图像，并通过叠加使之同时展示在一幅画面上；overlayoverlayoverlay 3)可完成断层扫描、三维重建、时间动态实时监测及波长扫描等。4.2 采图方法 逐层采集二维及三维荧光像高分辨率XY平面牛肺动脉内皮细胞 ，微管转导GFP的菌丝体高分辨率XY平面高分辨率XY平面检测人类癌细胞表皮生长因子高分辨率XY平面培养的293细胞中的绿色荧光蛋白（GFP）高分辨率XY平面培养的人肝癌细胞吖啶橙染色高分辨率XY平面 牛肺动脉内皮细胞蓝色：Hoechst 33342 染DNA红色：PI，染核仁RNA绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白选择感兴趣的区域（regions ofinterest,ROI)512 x 512512 x 512 Zoom IN三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞 透射光图像 利用荧光与透射光同时扫描，进行共定位