木聚糖酶活力的测定方法

1、木聚糖酶活力的测定方法1 .木聚糖酶活力单位定义在37C、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放lumol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。2 .测定原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。3 .试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1 乙酸溶液，c（CH3C

2、OOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.3 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化金内20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.4 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.5 木糖溶液

3、，c（C5H10O5）为10.0mg/ml：称取无水木糖1.000g,加缓冲液（3.4）溶解，定容至100ml。3.6 木聚糖溶液：1.0%（w/v）称取木聚糖（SigmaX0672）1.00g,加入氢氧化钠0.34g,磁力搅拌再加入60ml水，磁力搅拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0.5ml,再用乙酸溶液（3.1）调节pH值至5.5。继续搅拌30min,用缓冲液（3.4）定容至100ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4c避光保存，有效期为7天。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml,搅拌5s,水浴至45C。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（

4、3.4）,同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48C。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45c水浴加热，同时补加水300ml,不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光彳存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4 .仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器：附加热功能。4.6

5、电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45m。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060C之间，精度为0.1C。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。5 .标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.4）4.0ml,加入DNS试齐J（3.7）5.0ml,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml,制成标准空白样。分别吸取木糖溶液（3.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分别用缓冲液（3.4）定容至100ml,配制成浓度为0.100.70mg/ml木糖

6、标准溶液。分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试齐J（5.7）。电磁振荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mlo以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以木糖浓度为丫轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。6 .试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.4）。磁力搅拌30min,再用缓冲溶液（3.4）定容至100ml,

7、在4c条件下避光保存24ho摇匀，取出30-50ml,2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.4）做二次稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.040.08U/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液（3.1）或乙酸钠溶液（3.2）调节至5.5,然后再用缓冲溶液（3.4）做适当定容。7测定步骤吸取10.0ml木聚糖溶液（3.6）,37c平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37c平衡10

8、min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37c平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试齐J（3.7）,电磁振荡3s。然后加入2.0ml木聚糖溶液（3.6）,37c保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样（参见5）为空白对照，在540nm处测定吸光度Ab。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37c平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml木聚糖（3.6）（已经过37c平衡），电磁振荡3s,37c精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂（3.7）,电磁振荡3s,以终止酶解反应。沸水浴加热5min,用自来水冷却至

9、室温，加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度Ae。8.试样酶活力的计算（Ae-Ab）XK+CoXd=X1000MXt式（1）中：Xd一试样稀释液的木聚糖酶活力，U/ml;Ae酶反应液的吸光度；Ab酶空白样的吸光度；K一标准曲线的斜率；Co一标准曲线的截距；M一木糖的分子量（150.2）;t酶解反应时间，min;1000转化因子，1mmol=1000umol。Xd值应在0.040.08u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X=XdDf（2）式（2）中：X一试样木聚糖酶的活力，u/g;Df一试样的总稀释倍数。酶活力的计

10、算值保留三位有效数字。9重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。（3-葡聚糖酶活力的测定1 .3-葡聚糖酶活力单位定义在37C、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的3-葡聚糖溶液中降解释放lumol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位uo2 .测定原理3-葡聚糖酶能将3-葡聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中3-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可

11、以计算反应液中3-葡聚糖酶的活力。3 .试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1 葡糖糖溶液，c（C6H12。6）为10.0mg/ml：称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化金内20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲

12、溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.63-葡聚糖溶液：0.8%（w/v）称取3-葡聚糖（SigmaG6513）0.80g,加入10ml无水乙醇，润湿2分钟，再加入50ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至3-葡聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min,用乙

13、酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。3-葡聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4c避光保存，有效期为3天。冷冻保存，有效期为2个月（使用前在4c条件下解冻）。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml,搅拌5s,水浴至45C。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4）,同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48C。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45c水浴加热，同时补加水300ml,不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000

14、mlo用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4 .仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器：附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45m。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060C之间，精度为0.1C。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。4.12 移掖器；精度为11。5 .标准曲线

15、的绘制吸取缓冲液（3.5）4.0ml,加入DNS试齐J（3.7）5.0ml,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml,制成标准空白样。分别吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分别用缓冲液（3.5）定容至100ml,配制成浓度为0.100.70mg/ml葡萄糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试齐J（3.7）。电磁振荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在54

16、0nm处测定吸光度OD值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。6 .试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌30min,再用缓冲溶液（3.5）定容至100ml,在4c条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml,2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3

17、.5）进行稀释、定容（稀释后的酶液中葡聚糖酶活力最好能控制在0.040.08u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节、校正至5.5,然后再用缓冲溶液（3.5）做适当定容。吸取4.0ml3-葡聚糖溶液（3.6）,37c平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37c平衡10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37c平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂（3.7）,电磁振荡3s。然后加入2.0ml3-葡聚糖溶液（3.6）,40c保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml,电

18、磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度Ab。吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37c平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml葡聚糖溶液（3.6）（已经过37c平衡），电磁振荡3s,37c精确保温30min。加入5.0mlDNS试齐J（3.7）,电磁振荡3s,酶解反应。沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温，加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度Ae。8.试样酶活力的计算（Ae-Ab）XK+CoXd=X1000（1）MXt式（1）中：Xd试样稀释?中的3-葡聚糖酶活力，u/ml;Ae酶反应液的吸光度；Ab酶空白样的吸光度；

19、K一标准曲线的斜率；Co一标准曲线的截距；M一葡萄糖的分子量（180.2）;t酶解反应时间，min;1000转化因子，1mmol=1000umol。Xd值应在0.040.08u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X=XdDf（2）式（2）中：X一试样3-葡聚糖酶的活力，u/g；Df一试样的总稀释倍数。酶活力的计算值保留三位有效数字。9重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。纤维素酶活力的测定1 .纤维素酶活力单位定义在37C、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的竣甲基纤维素钠

20、溶液中降解释放lumol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位uo2 .测定原理纤维素酶能将竣甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。3 .试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1 葡糖糖溶液，c（C6H12。6）为10.0mg/ml：称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（

21、CH3COOH）为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化金内20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.6竣

22、甲基纤维素钠溶液：0.8%（w/v）称取竣甲基纤维素钠（SigmaC5678）0.80g,加入80ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至竣甲基纤维素钠完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min,用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。竣甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4c避光保存，有效期为3天。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml,搅拌5s,水浴至45C。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4）,同时不断搅拌，直到溶液

23、清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48C。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45c水浴加热，同时补加水300ml,不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mlo用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器：附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：

24、孔径为0.45m。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060C之间，精度为0.1C。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。4.12 移掖器；精度为11。5标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.5）4.0ml,加入DNS试齐J（3.7）5.0ml,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml,制成标准空白样。分别吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分别用缓冲液（3.5）定容至100ml,配制成浓度为0.100.70mg/ml葡萄糖标准溶

25、液。分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试齐J（3.7）。电磁振荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以葡萄糖浓度为丫轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。4.13 液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌30min,再用缓冲溶液（3.5）定容至100ml,在4

26、c条件下避光保存24ho摇匀，取出30-50ml,2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）进行稀释、定容（稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节、校正至5.5,然后再用缓冲溶液（3.5）做适当定容。7测定步骤吸取10.0ml竣甲基纤维素钠溶液（3.6）,37c平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37

27、c平衡10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37c平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试齐J（3.7）,电磁振荡3s。然后加入2.0ml竣甲基纤维素钠溶液（3.6）,37c保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度Ab。吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37c平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml竣甲基纤维素钠（3.6）（已经过37c平衡），电磁振荡3s,37c精确保温30min。加入5.0mlDNS试齐J（3.7）,电磁振荡3s,酶解反应。沸水浴加热5min,用自

28、来水冷却至室温，加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度Ae。8.试样酶活力的计算（Ae-Ab）XK+CoXd=X1000（1）MXt式（1）中：Xd一试样稀释液中的纤维素酶活力，u/ml;Ae酶反应液的吸光度；Ab酶空白样的吸光度；K一标准曲线的斜率；Co一标准曲线的截距；M一葡萄糖的分子量（180.2）;t酶解反应时间，min;1000转化因子，1mmol=1000umol。Xd值应在0.040.08u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X=XdDf（2）式（2）中：X一试样纤维素酶的活力，u/g;Df一试样的总

29、稀释倍数。酶活力的计算值保留三位有效数字。9重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。果胶酶活力的测定1 .酶活定义在pH5.5、37c下，每分钟内从浓度为4mg/ml的底物（Fluka76280或SigmaP9135）溶液中分解释放1umol还原物质（表述为半乳糖醛酸）所需要的酶量为一个酶活单位uo2 .测定原理果胶酶能将聚半乳糖醛酸降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中果胶酶的活力成正比。因此

30、，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中果胶酶的活力。3 .试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1 葡糖糖溶液，c（C6H12。6）为10.0mg/ml：称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氢氧化金内20.0g。加水溶解，定容至1

31、00ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOHCH3COONa）为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.6聚半乳糖醛酸溶液：0.8%（w/v）称取果胶（SigmaP9135）0.80g,加入80ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至聚半乳糖醛酸完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min,用乙酸一乙

32、酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。聚半乳糖醛酸溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4c避光保存，有效期为3天。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml,搅拌5s,水浴至45C。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4）,同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48C。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45c水浴加热，同时补加水300ml,不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mlo用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光

33、保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4仪器与设备1.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。1.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。1.3 分析天平：感量0.001g。1.4 pH计：精确至0.01。1.5 磁力搅拌器：附加热功能。1.6 电磁振荡器。1.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45m。1.8 离心机：2000g以上。1.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060C之间，精度为0.1C。1.10 秒表：每小时误差不超过5s。1.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。1.12 移掖器；精度为11。5 .标准曲线制备标准一水A半乳糖醛酸溶液，一水半乳糖醛酸的浓度范围应在1

34、10mg/m1之间。用缓冲液溶解1.0克一水半乳糖醛酸，定容至100ml,获得浓度为10mg/m1的半乳糖醛酸溶液。然后用缓冲液作系列稀释，配制浓度为0、0.1mg/m1、0.2mg/m1、0.3mg/m1、0.4mg/m1、0.5mg/m1、0.6mg/m1、0.7mg/m1和8.0mg/m1的标准底物溶液。吸取2.0m1标准溶液和2.0m1蒸储水，加入到试管中。震荡，加入5m1DNS试剂，震荡、蒸煮5分钟。然后在自来水中冷却。再用蒸储水定容至25ml。震荡摇匀，在2000g离心10min,取滤液，以浓度为0的反应液（标准空白样）作为基准，调零。在540nm处测定吸光度。测定值做2个重复，取

35、平均值。每次更换DNS试剂，标准曲线需要重新绘制。6 .酶活测定精确称取1.000克样品用缓冲液溶解酶样，稀释至适当浓度。酶样吸光度A吸取2.0ml酶稀释液，加入到试管中，加入2.0ml果胶底物溶液，在40c平衡，震荡。在40c精确水浴30分钟。加入5m1DNS试剂，混合。用帽塞盖住试管。在沸水中精确保温5分钟。然后，在冰水中终止反应。再蒸储水定容至25ml,充分摇匀，在2000g离心10min。取上清液，以标准空白样为基准，调零，在540nm处测定吸光度（吸光度在0.150.7之间，如果超过此范围，重新确定稀释度。）。测定值做2个重复，取平均值。酶空白样吸光度Ao吸取2.0ml聚半乳糖醛酸溶

36、液，在37c精确保温30min。加入5m1DNS试剂，震荡。加入2.0ml酶的稀释液，混合。在沸水中精确蒸煮5min。然后用水冷却，终止反应。用蒸储水定容至25ml,充分摇匀，然后在2000g离心10min,取上清液。以标准空白样为基准，调零，在540nm处测定吸光度。测定值做2个重复，取平均值。7 .酶活计算AxAoXKX1000XDf(u/g)酶活A=WtAx:酶样的吸光度；Ad：酶空白样的吸光度；K:标准曲线的斜率；1000:转换因子1mmol=1000umol;D:稀释倍数；W一水半乳糖醛酸的分子量（212.16）;t:反应时间（min）。1 .甘露聚糖酶活力单位定义在37C、pH值为

37、5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖(SigmaG0753)溶液中降解释放lumol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位uo2 .测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。3 .试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1 甘露糖溶液，c(C6H12O6)为10.0mg/ml：

38、称取无水D-甘露糖1.000g,加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸钠溶液，c(CH3COONa)为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氢氧化钠溶液，c(NaOH)为200g/L：称取氢氧化金内20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液，c(CH3COOHCH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果p

39、H值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5。3.6甘露聚糖溶液：0.6%(w/v)称取甘露聚糖(SigmaG0753)0.60g,加入80ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液(3.5)。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解(注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。)。然后停止加热，继续搅拌30min,用乙酸一乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4c避光保存，有效期为3天。3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯)，加水500ml,搅拌5s,水浴至45C。然后逐步加

40、入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48C。)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45c水浴加热，同时补加水300ml,不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mlo用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH计：精确至0.01。4.5 磁力搅拌器

41、：附加热功能。4.6 电磁振荡器。4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45m。4.8 离心机：2000g以上。4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在3060C之间，精度为0.1C。4.10 秒表：每小时误差不超过5s。4.11 分光光度计：能检测350800nm的吸光度范围。4.12 移掖器；精度为11。5标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.5）4.0ml,加入DNS试齐J（3.7）5.0ml,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml,制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分别用缓冲液（3.5）定容至10

42、0ml,配制成浓度为0.100.70mg/mlD-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试齐J（3.7）。电磁振荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以甘露糖浓度为丫轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。6试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力

43、搅拌30min,再用缓冲溶液（3.5）定容至100ml,在4c条件下避光保存24ho摇匀，取出30-50ml,2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸一乙酸钠缓冲溶液（3.5）进行稀释、定容（稀释后的酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.040.08u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节、校正至5.5,然后再用缓冲溶液（3.5）做适当定容。7测定步骤吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37c平衡

44、10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37c平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂（3.7）,电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液（3.6）,37c保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度Ab。吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37c平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml甘露聚糖溶液（3.6）（已经过37c平衡），电磁振荡3s,37c精确保温30min。加入5.0mlDNS试齐J（3.7）,电磁振荡3s,酶解反应。沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温，

45、加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度Ae。8.试样酶活力的计算（Ae-Ab）XK+CoXd=X1000（1）MXt式（1）中：Xd一试样稀释液中的甘露糖聚酶活力，u/ml;Ae酶反应液的吸光度；Ab酶空白样的吸光度；K一标准曲线的斜率；Co一标准曲线的截距；M一甘露糖的分子量（180.2）;t酶解反应时间，min;1000转化因子，1mmol=1000umol。Xd值应在0.040.08u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X=XdDf（2）式（2）中：X一试样甘露聚糖酶的活力，u/g;Df一试样的总稀释倍数。酶

46、活力的计算值保留三位有效数字。9重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。1 .酶活定义在37C、pH3.0条件下，每分钟从浓度为1.0%的酪蛋白溶液中降解释放1微克酪氨酸所需要的酶量为一个酶活单位Uo2 .测定原理蛋白酶在一定温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。在碱性条件下，含有酚基的氨基酸可以将福林试剂还原，生成铝蓝和鸨蓝。用分光光度计测定反应液的颜色强度，对照标准曲线计算酪氨酸的产生量和酶活力。3 .配制副林试剂在2000ml磨口回流装置中加入鸨酸钠（Na2WO4-2H2O）100g、铝酸钠（Na2MoO42H2O）25g,水700ml、85%的磷酸50ml、浓盐酸100ml,小心沸腾回流10h。再取下回流冷凝器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50ml和数滴浓滨水（99.0%）,沸腾15min,以除去多余的澳。如冷却后仍有绿色，需要再加滨水，再煮沸除去过量的澳。冷却，加水定容到1000mlo制得的试剂应呈黄色，存储在棕色瓶内。使用时加2倍的蒸储水稀释。4 .绘制标准曲线称取干燥无水的酪氨酸0.1000g,用0.1mol/L的盐酸溶液