第六章分子生物学研究法

1、第六章分子生物学研究法(下)基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。用基因定点突变(site-directedmutagenesi

2、s)技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔朧。6.1基因表达研究技术6.1.1转录组测序6.1.1转录组分析和RNA-Seq转录组(transcriptome)，广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、

3、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)及非编码RNA(non-codingRNA或sRNA)；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。基因组一转录组一蛋白质组(genometranscriptomeproteome)是中心法则在组学框架下的主要表现形式。通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。聞創沟燴鐺險爱氇谴净祸測樅。转录组研究的基本方法包括基因芯片技术(genechip)和转录组测序技术。我们将在6.4节详细叙述基因芯片技术，这里主要讨论转

4、录组测序技术的原理和应用。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟婭骤東。基于传统的Sanger测序法对转录组进行研究的方法主要包括：表达序列标签(expressedsequeneetag,EST)测序技术，基因表达系列分析技术(serialanalysisofexpression,SAGE)。EST测序数据是目前数量最多，涉及物种最广的转录组数据，但测序读长较短(每个转录本测定4OObp500bp),测序通量小，测序成本较高，而且无法通过测序同时得到基因表达丰度的信息。有人使用SAGE测序法，将不同转录本3'端第一个CATG位点下游14bp长的短标签序列来标识相应的转录本。由于标签序列较短，可以将多个标

5、签串联测序，使SAGE法相对于EST测序在通量上大大提高。但过短的序列标签使得序列唯一性降低，即使改进过的LongSAGE用21bp标签测序，仍然有约一半的标签无法被准确注释到基因组上。酽锕极額閉镇桧猪訣锥顧荭钯。高通量测序技术(high-throughputsequencing),又名二代测序(second-generationsequencing)或深度测序(deepsequencing),可以一次性测序几十万甚至几百万条序列，是传统测序技术的一次革命。主要有Roche公司研发的454测序平台和川umina公司的Solexa测序平台(表6-1)。彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑诒尔肤。表6-1454和

6、川umina高通量测序平台比较454Illumina读取长度(bp)约70050150单次测序数据量700Mb600Gb23小时较咼714天低虽然都是基于边合成边测序(sequencingbysynthesis,SBS)”，但是454和川umina的实现方法有很大的不同。454系统采用焦磷酸测序(pyrosequencing)原理，如图6-1a所示，在DNA聚合酶的作用下，按照T、A、C、G顺序加入的单个dNTP与模板的下一个碱基配对，同时释放一个分子的焦磷酸(PPi)，在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和腺苷酰硫酸(adenosine-5'-phosphosulfate,APS)结合形

7、成ATP，在萤光素酶的催化下，ATP和萤光素结合形成氧化萤光素，产生可见光，被CCD捕捉。而lllumina系统(图6-1b)采用带有萤光标记的dNTP，其3'羟基末端带有可被化学切割的部分，每个循环反应只允许掺入一个碱基，由激光扫描反应板表面，读出这一轮反应新加的萤光信号，从而判定碱基种类。之后，经过化学切割恢复3'端粘性，进行下一轮聚合反应。从上述描述中不难看出，随着反应的进行，已有萤光信号会使新的荧光难以准确分辨，因此该方法的测序读长较短，测序错误主要是碱基替换。而454则由于缺少终止反应的元件，相同碱基的连续掺入常会带来插入一缺失”类型的测序错误。謀荞抟箧飆鐸怼类蒋薔點

8、鉍杂。利用高通量测序技术对转录组进行测序分析，对测序得到的大量原始读长(reads)进行过滤、组装及生物信息学分析的过程被称为RNA-Seq。对于有参考基因组序列的物种，需要根据参考序列进行组装(refereneeassembly),对于没有参考序列的，需要进行从头组装(denovoassembly),利用大量读长之间重叠覆盖和成对读长(pair-endreads)的相对位置关系，组装得到尽可能完整的转录本，并以单位长度转录本上覆盖的读长数目(readsperkilo-basegenepermillionbases,RPKM)作为衡量基因表达水平的标准(图6-2)。在实际组装过程中，图中红色标

9、示区域覆盖度过低，且读长缺乏相对位置信息的区域，其可信度较低，应当剔除，保留两侧序列。厦礴恳蹒骈時盡继價骚卺癩龔。现以棉花转录组学数据为例，简单分析不同组织或纤维不同发育时期基因表达情况(表6-2)。lllumina平台测序得到26.86Gb数据，经过从头组装总共获得了42,773条非重复序列，平均长度1,054碱基。每个不同组织中分别有23,265至26,427个独立转录本。转录组数据不但能用来分析不同组织中独立转录本数量，还被用于分析特定转录本在某个组织中的表达强度(表6-3)。RNA-Seq还可以用于转录本结构、转录本SNP检测、非编码区功能鉴定以及挖掘低丰度转录本等研究。茕桢广鳓鯡选块

10、网羈泪镀齐鈞。表6-2陆地棉6个组织的RNA-Seq数据分析组织样品读长数碱基数Q201(%)N50独立基因总数独立基因长度(nt)开花后0天胚珠47907298359304735098.2282726427778开花后5天胚珠53022210397666575097.8684223520786花48049786360373395097.9982323265775叶54191238406434285097.5182025280776根79438254714944286091.6878623905753茎49713024447417216091.4678224088746总计3323218102

11、686140492013064277310541Q20，测序准确率达到99%。表6-3棉花组织特异性转录因子表达强度分析序列标识基因RPKM序列标识基因RPKM根茎根茎Unigene58528MYB-L81.860.16Unigene85367FAR10.4065.51Unigene58563B356.020.00Unigene29146HD-ZIP0.0044.49Unigene58582B353.660.29Unigene51008HB0.2443.60Unigene58458Dof45.540.00Unigene18073MIKC0.1336.74Unigene55872Dof41.56

12、0.00Unigene64521MYB0.1531.71Unigene51911bHLH36.640.19Unigene58698B30.0924.01Unigene58446NAC28.400.37Unigene62109MYB0.0418.45Unigene57837bHLH20.270.00Unigene52681bZIP0.2017.62Unigene58640S1Fa-L20.250.68Unigene64531G2-L0.3416.92Unigene55579B315.710.13Unigene64486bHLH0.0014.49转录组组装过程中，同一个非重复序列上复盖有来自根、茎

13、等不同组织的读长，不同读长数目通过归一化转变为RPKM值，进而筛选得到组织特异表达的转录因子。鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴縈诘聾。6.1.2RNA的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。一般将选择性剪切分为如下几类：平衡剪切、5'选择性剪切、3'选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切（图6-3）。一般用RT-PCR的方法研究一个基因是否存在选择性剪切。首先以cDNA两端特异引物或来自不同外显子的引物序列在不同组织来源的RNA样品中进行扩增，观察PCR产物大小是否存在差异。一旦发现差异，即

14、可通过序列分析来判断这种差异是否来自于选择性剪切。图6-4为拟南芥中发现的有选择性剪切的5个转录调控因子基因的物理图谱。选择性剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。分析人类基因组数据发现，有60%的基因在表达过程中可通过选择性剪切产生各种形式的mRNA。最新的研究表明，果蝇的Dscam基因最多可能够产生38，016种不同形式的剪切体（图6-5）。由于选择性剪切与细胞生理、发育调节以及肿瘤的发生、转移等有密切关系，阐明基因的选择性剪切机制是了解动植物个体发育和基因功能的重要环节。因此，发现新的可变剪切异构体，确定每个异构体的独特功能和生物学意义并阐明其调节机制，是功

15、能基因组时代的一个重要特征。籟丛妈羥为贍债蛏练淨槠挞曉。6.1.3原位杂交技术原位杂交（InSituHybridization,ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，通常分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析（图6-6）。預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴買闥龅。荧光原位杂交（

16、fluoresceneeinsituhybridization,FISH）技术首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置（图6-7）。FISH技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高，若用经过不同修饰的核苷酸分子标记不同的DNA探针，还可能在同一张切片上观察几种DNA探针的定位，得到相应位置和排列顺序的综合信息。渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦鋇絨钞。6.1.4基因定点突变（site-directedmutagenesis）技术定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定

17、位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。由于迄今尚未建立能精确预测特定氨基酸残基变化对整个蛋白结构及活性影响的模型，选择氨基酸突变的位点存在一定的盲目性。因为即使知道了该蛋白的三维结构，人们仍然无法了解某个氨基酸残基对其高级结构的影响。少数几个氨基酸残基的改变，有时根本不影响靶蛋白的功能，有时影响了靶蛋白的活性位点，有时还能从根本上改变整个蛋白的高级结构。所以，基因的定点突变是我们进一步了解蛋白质的结构与功能关系的重要手段。铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡缝勵

18、罴。最早在20世纪70年代初进行小噬菌体X174单链基因组易突变位点图谱分析工作时认识到基因定点突变的可能性。在人工成功合成寡聚核苷酸、获得高品质DNA聚合酶和DNA连接酶的基础上，科学家建立了体外寡核苷酸介导的DNA突变技术（图6-8）。PCR技术的出现大大促进了定点突变技术的发展，简化了实验操作程序，提高了突变效率。科学家主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。擁締凤袜备訊顎轮烂蔷報赢无。图6-9阐述了重叠延伸介导的定点诱变机制。首先将模板DNA分别与引物对1（正向诱变引物FM和反向引物R2）和2（正向引物F2和反向诱变引物RM）退火，通过PCR1和2

19、反应扩增出两种靶基因片段。FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火，用DNA聚合酶补平缺口，形成全长双链DNA，进行PCR3扩增。最后，用引物F2和R2扩增出带有突变位点的全长DNA片段（PCR4）。贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷鯛汉鼉。大引物诱变法首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板DNA产生双链大引物（PCR1），与野生型DNA分子混合后退火并使之复性，第二轮PCR中加入正向引物（F2），与PCR1中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA（图6-10）。由于F2的退火温度显著高于第一轮PCR所使用的引物M和R1，因此，可以忽略引物M和R1在本轮反应中所造成的干扰。获得定点突

20、变PCR产物以后，一般需进行DNA序列分析以验证突变位点。坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚跻馱釣。与经典定点突变方法相比，PCR介导的定点突变方法具有明显的优势：1、突变体回收率高，以至于有时不需要进行突变体筛选；2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突变；3、可在同一试管中完成所有反应；4、快速简便，无需在噬菌体M13载体上进行分子克隆。所以，PCR介导的定点突变方法已成为定点突变的主要技术。蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘籜葦繯。6.2基因敲除技术6.2.1基本原理经典遗传学（Forwardgenetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。在后基因组时代，大规模基因功能的

21、研究正成为生命科学研究的热点，现代遗传学（Reversegenetics,反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除（geneknock-out）又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改造,具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄届嬌擻。1985年，科学家利用同源重组将一段外源质粒pA31171入到人类染色体DNA3-珠蛋白位点，首次在哺乳动物细胞中进行基因打靶并获得成功。目前,在胚胎干细胞中进行同源重组已经成为遗传修饰基因组位点的常规技术。通过对这些基因敲除生物个体的表

22、型分析,鉴定或推测该基因的生物学功能。綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴飙钪麦。基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性,条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统,尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦諑琼针。1完全基因敲除实验中一般采用取代型或插入型载体（图6-11）在ES细胞中根据正-负双向选择（positive-negativeselectio

23、n,PNS）原理（图6-12）进行完全基因敲除实验。正向选择基因neo通常被插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。neo基因有双重作用，一方面形成靶位点的插入突变，同时可作为正向筛选标记。负向选择基因HSV-tk（humansemianvirus-thymidinekinase）则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为10-210-5,植物的概率为10-410-5,即使采用双向选择法也很难保证一次就从众

24、多细胞中筛选出真正发生了同源重组的胚胎干细胞，必须用PCR及Southern杂交等多种分子筛选技术验证确实获得了目的基因被敲除的细胞系。猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑献鵬缩。2条件型基因敲除对于许多有重要生理功能的基因来说，完全基因敲除往往导致胚胎死亡，有关该基因功能的研究便无法开展。而条件型基因敲除，特别是应用Cre/LoxP和FLP/FRT系统所开展的组织特异性敲除，由于其可调节性而受到科学家的重视。构建条件型基因敲除打靶载体时，常将正向选择标记neor置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入方向相同的LoxP位点（图6-13）。当实验中需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因

25、的ES细胞杂交，Cre重组酶就能把两个LoxP位点中间的DNA片段切除，导致靶基因失活。标记基因两侧也常常带有LoxP序列，因为许多时候即使标记基因位于内含子中也会阻断靶基因的转录。一旦出现这种情况，可以用Cre重组酶表达质粒转染中靶ES细胞，通过LoxP位点重组将neo抗性基因删除。锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔嗚訝摈。以Cre/loxp系统为基础，可以在动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰。利用控制Cre表达的启动子活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导性的特征，人们常常通过设定诱导时间的方法对动物基因突变的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。構

26、氽頑黉碩饨荠龈话骛門戲鷯。6.2.2高等动物基因敲除技术胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达，主要实验流程及筛选步骤如图6-14所示。輒峄陽檉簖疖網儂號泶蛴镧釃。利用Neo基因替换目的基因外显子IV至外显子VI区段，得到肠碱性磷酸酶（IntestinalAlkalinePhosphataseIAP）基因敲除的ES细胞，用显微注射或电穿孔法将I

27、AP基因敲除的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔中，诱导胚胎分化，获得嵌合体胚胎后与野生型纯合体胚胎回交，获得由ES细胞分化产生的IAP基因敲除小鼠，实验证明，纯合小鼠体内检测不到IAP蛋白，而该基因的敲除导致小鼠变胖（图6-15）。在条件型基因敲除实验中，首先构建带有S6基因的LoxP打靶载体的ES细胞，经过杂交筛选，获得纯合体小鼠；再与带有肝组织特异性、受INF-a诱导的Mx-Cre转基因小鼠杂交，删除neo和外显子3-5,得到肝组织特异性敲除S6基因小鼠后发现，3H胸腺嘧啶不能掺入S6基因敲除小鼠肝组织，细胞不能进入S期，不能正常分裂增殖（图6-16）。尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅瀝纰縭。一般来说,动

28、物基因敲除时用显微注射胚胎干细胞命中率较高,技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低,但操作相对简单易行。识饒鎂錕缢灩筧嚌俨淒侬减攙。因为同源重组常常发生在某一条染色体上,要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，至少需要两代以上的遗传。除了基因敲除法，还有人用基因捕获的方法通过随机插入突变破坏靶基因表达（图6-17）。基因捕获载体包括一个无启动子的报告基因（通常为neor基因），当该基因插入到ES细胞染色体某个部位，利用所在位点的转录调控元件得到表达时，该ES细胞就获得在含G418的选择性培养基上生长的能力。可通过分析标记基因侧翼cDNA或染色体DNA序列来获得靶基因的相关信息。凍鈹鋨劳臘锴痫

29、婦胫籴铍賄鹗。由于受整合位点附近染色质区的影响，转基因整合具有显著的位置效应，基因5'端启动子和增强子区，3'端终止子区都会对转基因的整合产生影响，这是某些打靶载体选择组织特异性启动子的原因之一。外源转基因的有效表达有时还取决于其是否有内含子，因为内含子中存在的转录调控元件可影响mRNA的剪切以及启动子与内含子间的相互作用。另外，内含子可能含有能开放染色体功能域的序列，还可能通过影响核质成分、位置等来影响基因表达强度。恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦聰櫻郐。除了研究基因功能之外，基因敲除技术还被广泛应用于建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供遗传学数据，为遗传病的治疗、为生物新品种的

30、培育奠定新基础。鯊腎鑰诎褳鉀沩懼統庫摇饬缗。6.2.3植物基因敲除技术由于动植物细胞结构显著不相同，植物细胞基因敲除常采用不同于动物细胞的策略。T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。T-DNA插入失活就是利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。由于该基因内部或附近插入了一段已知序列的DNA，可据此设计引物，用PCR方法将被破坏的靶基因序列分离出来（图6-18A）。若将靶基因（假定编码区为900个碱基对）两端的引物LP、RP及插入载体上的

31、引物LB加入同一反应体系中进行PCR,理论上能得到三种类型的条带（图6-18B）。野生型植株中，只有LP和RP引物配对扩增出来的靶基因条带；如果实验材料来自纯合型基因敲除植株，那么，只有靶基因一端的引物可以与LB引物配对完成PCR扩增；如果实验材料来自杂合型基因敲除植株，那么，PCR扩增后会同时出现两种条带。硕癘鄴颃诌攆檸攜驤蔹鸶胶据。T-DNA无专一整合位点，在植物基因组中发生随机整合，所以，只要突变株的数目足够大，从理论上就可能获得任何一个功能基因都发生突变的基因敲除植物库。拟南芥基因组冗余序列少，基因密度高，几乎每一个DNA插入都会导致某个基因功能的丧失，结合已完成的拟南芥基因组信息，人

32、们很容易筛选到新的功能基因。已经用T-DNA插入失活方法建立了拟南芥大规模基因敲除突变体库，研究人员可以方便地在多个数据库中检索到感兴趣基因的突变体，再开展深入的表型分析和功能研究。阌擻輳嬪諫迁择楨秘騖輛埙鵜。6.3蛋白质及RNA相互作用技术6.3.1酵母单杂交系统酵母单杂交系统（yeastone-hybridsystem）是上个世纪90年代中期发展起来的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。此外，该体系也是分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用的有效方法。氬嚕躑竄

33、贸恳彈瀘颔澩纷釓鄧。酵母单杂交的基本原理如图6-19所示，首先将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimalpromoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。然后，将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（transcriptionactivationdomain,AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。釷鹆資贏車贖孙滅獅赘慶獷緞。目前，酵母单杂交体系主要被用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用，用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因，

34、验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。由于该方法的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量极低且用生化手段难以纯化的那部分转录调控因子。常用的酵母单杂交体系基本选用HIS3或LacZ作为报告基因，虽然有的体系将带有报告基因的载体直接整合于酵母染色体上，在大部分的实验中报告基因都位于质粒DNA上。图6-20是利用酵母单杂交体系和已知的顺式作用元件DRE从拟南芥cDNA文库中筛选转录调控因子的基本流程。实验中如果将不同的未知基因与酵母GAL4的DNA结合结构域相融合，通过检测位于GAL4顺式作用元件下游的报告基因的表达状况，还可以鉴定出该转录因子是否具

35、有转录激活功能。怂阐譜鯪迳導嘯畫長凉馴鸨撟。6.3.2酵母双杂交系统（Yeasttwo-hybridsystem）该体系巧妙地利用真核生物转录调控因子的组件式结构（modular）特征，因为这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（bindingdomain，BD）和转录激活结构域AD是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。实验中，首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调控因子（常为GAL1、GAL4或GCN1）DNA

36、结合结构域编码区（BD）的表达载体上。导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。此时，若将已知的编码转录激活结构域（AD）的DNA分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得“猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母细胞。一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物”载体，就能得到与已知蛋白相互作用的新基因（图6-21）。谚辞調担鈧谄动禪泻類谨觋鸾。

37、6.3.3蛋白质相互作用技术1、等离子表面共振技术该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，将葡聚糖层固定于纳米级厚度的金属膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用（图6-22）。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点是需要专门的等离子表面共振检测仪器。嘰觐詿缧铴嗫偽純铪锩癱恳迹。图6-23应用SPR技术研究COI1蛋白与JAZ1蛋白之间的相互作用。研究人员首先在葡聚糖芯片表面固定1000共振单位的茉莉酸（

38、JA）信号通路负调控因子JAZ1蛋白，当体系中同时有茉莉酸异亮氨酸（JA-lle）及COI蛋白存在时，可以检测到最高达380共振单位的SPR反应信号。加入一种在结构和功能上与茉莉酸甲脂（MeJA）非常相似的名为冠毒素（COR）的细菌毒素，也能使COl1和JAZ1发生相互作用。熒绐譏钲鏌觶鷹緇機库圆鍰缄。2、免疫共沉淀技术（Co-lmmunoPrecipitation，ColP）该技术的核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。首先，将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀

39、到试管的底部或微膜上。如果靶蛋白质与待筛选蛋白发生了相互作用，那么，这个待筛选蛋白质就通过靶蛋白与抗体和固体基质相互作用而被分离出来（图6-24）。鶼渍螻偉阅劍鲰腎邏蘞阕簣择。免疫共沉淀实验中常用pGADT7和pGBKT7质粒载体分别以融合蛋白形式表达靶蛋白，体外转录、翻译后将产物混合温育，分别用Myc或HA抗体沉淀混合物，过柱后再用SDSPAGE电泳分离，检测两个靶蛋白之间是否存在相互作用（图6-25）。实验表明，棉花乙烯合成酶基因ACS2与钙离子依赖性蛋白激酶CDPK1之间存在相互作用，而该蛋白与CDPK32及CRK5没有发生相互作用。ACO1与这三个蛋白都没有发生相互作用（图6-26）。纣忧蔣氳頑莶驅藥悯骛覲僨鴛。3、GST及GAD融合蛋白沉降技术