专题一基因工程基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取目的基因的获取 2.表达载体的构建表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞4.目的基因的的检测与鉴定目的基因的的检测与鉴定第一步第一步: :目的基因的获取目的基因的获取 常用的方法常用的方法 1 1 从基因文库中获取从基因文库中获取目的基因目的基因2 2 已知序列已知序列: :利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 3 3 基因较小已知序列基因较小已知序列: :通过通过DNADNA合成仪用合成仪用化学方法直接人工合成化学方法直接人工合成目的基因目的基因未知序列的建立基因组文库从中获得目的基因未知序列的建立基因组文库从中

2、获得目的基因已知已知mRNAmRNA序列用反转录法建立序列用反转录法建立cDNAcDNA文库获得目的基因文库获得目的基因理论支持理论支持:DNA:DNA复制原理复制原理基因组含此种生物的一整套遗传信息如如:cDNA:cDNA文库文库基基因因组组文文库库cDNAcDNA文库文库提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库与载体连接与载体连接导入受体菌导入受体菌群群mRNA逆转录逆转录酶酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA(cDNA)该

3、生物该生物cDNA文库文库知识点一：知识点一：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起聚合酶结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能片断，它能阻碍阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动

4、，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落) )不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重

5、要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 知识点一：知识点一：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核真

6、核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点等。聚合酶结合位点等。比较比较见教材第见教材第10页表格页表格 野生稻是水稻的原始祖先，被专家野生稻是水稻的原始祖先，被专家称为称为“植物中的大熊猫植物中的大熊猫”，蕴藏着十分，蕴藏着十分丰富的优良基因。世界上目前共有丰富的优良基因。世界上目前共有20种种野生稻种，其中中国有野生稻种，其中中国有3种，即药用野

7、生种，即药用野生稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中国野稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中国野生稻在云南分布最广，生态类型多。生稻在云南分布最广，生态类型多。 调调查显示作为我国野生稻资源最丰富的广查显示作为我国野生稻资源最丰富的广东和海南，普通野生稻的个分东和海南，普通野生稻的个分布点已消失了。云南省农科院生布点已消失了。云南省农科院生物技术与种质资源研究所目前为该省分物技术与种质资源研究所目前为该省分布的布的3种野生稻建立了基因文库种野生稻建立了基因文库( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念

8、：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _ _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _._.原理原理: :_ _方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增利用利用PC

9、RPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程过程：a a、DNADNA变性变性（90-990-95 5）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_B B、复性复性（5 55-65-60 0）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链DNA合成仪合成仪推推测测推推测测合合成

10、成1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是应的内容，正确的组合是2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反转录形成从基因组文库中提取反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出

11、口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒：实际上是不同来源的基因分子（重组质粒：实际上是不同来源的基因重组的过程）重组的过程）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同第二步：基因表达载体的构建第二步：基因表达载体的构建 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的

12、抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 作为基因表达载体只需含有目的基因就可以完成任务吗作为基因表达载体只需含有目的基因就可以完成任务吗? ? 下列结构中是基因表达下列结构中是基因表达载体组成必需的是载体组成必需的是？ A A、目的基因目的基因 B B、启动子启动子 C C、终止子终止子 D D、标记基因标记基因 E E、抗生素基因抗生素基因

13、 F F、复制原点、复制原点第二步第二步: : 基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心 复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因构建目的：构建目的：使目使目的基因在受体细的基因在受体细胞中稳定存在，胞中稳定存在，并且可以遗传给并且可以遗传给下一代，同时使下一代，同时使目的基因能够表目的基因能够表达和发挥作用。达和发挥作用。第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因

14、导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌农杆菌转化转化法法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。 目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 农杆菌农杆菌 导入植物细胞导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因的遗传特性得以维持稳定和表

15、达3.转转化化你能分析出农杆菌不能将目的基因导入到你能分析出农杆菌不能将目的基因导入到单子叶植物的原因吗单子叶植物的原因吗? ?若想将一个抗病基若想将一个抗病基因导入小麦中因导入小麦中, ,理论上你认为应该怎么做理论上你认为应该怎么做? ?（2）基因枪法基因枪法( (单子叶植物常用的方法单子叶植物常用的方法) ) （3）花粉管通道法：花粉管通道法：（我国科学家独创，（我国科学家独创， 如转基因抗虫棉）如转基因抗虫棉）2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显

16、微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物2.微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：转化方法：大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。Ca2+感受态感受态感受态感受态1.常用菌：常用菌：第三步第三步: :将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞生物种类生物种类植物植物动物动物微生物微生物常用方法常用方法受体细胞受体细胞农杆菌转农杆菌转化法化法显微注射显微注射法法Ca2+处理法处理法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原

17、核细胞第四步第四步: :目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 外 源外 源基因基因受体细胞受体细胞染色体染色体mRNAmRNA蛋白蛋白质质性状性状 检测：导入？检测：导入？ 检测：转录？检测：转录？ 检测：翻译？检测：翻译？ 鉴定：表现？鉴定：表现？ DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交抗虫鉴定、抗虫鉴定、抗病鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等活性鉴定等复复性性抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :抗原抗原-抗体杂交抗体杂交例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未

18、摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成 构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定

19、：鉴定：练一练练一练1 1：由同一种限制性内切酶切割成的黏性末端是：由同一种限制性内切酶切割成的黏性末端是TCG TCG AATTCGA AATTCGA AGCTTAA GCT AGCTTAA GCT CA CA AGCTTC AGCTTC AATTGA AATTGA GTTCCA AG ACT GTTCCA AG ACT A A、 B B、 C C、 D D、 E E、2.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加

20、质粒分子的分子量D便于与外源基因连接3.3. 有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料4.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因5.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( ) A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取

21、，来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg100Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g4-5g的胰岛素，其产的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。量之低和价格之高可想而知。 假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？ 尝试设计尝试设计 植物基因工程硕果累累植物基因工程硕果累累动物基因工程前景广阔动物基因工程前景广阔基因工程药物异军突起基因工程药物异军突起基因治疗曙光初照基因治疗曙光初照基因工程的应用基因工程的应用1.植物基因工程硕果累累植物基因工程硕果累累 1）抗虫转基因植物）抗虫转基因植物 2）抗病转基因植物）抗病转基因植物 3）抗逆转基因植物）抗逆转基因植物 4）改良植物品质）改良植物品质2.动物基因工程前景广阔动物基因