基因工程操作程序2

1、原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的编码区下游的DNA序列，虽不序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等序列，如启动子、终止子等第1页/共35页原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构 RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，

2、RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。第2页/共35页真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。第3页/共35页真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质外显子：能编码蛋白质的的DNA序列序列内含子：不能编码蛋白内含子：不能编码蛋白质的质的DNA序列序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启

3、非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子动子、终止子第4页/共35页原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是连续的连续的编码区是间隔编码区是间隔的、不连续的的、不连续的相同点相同点都由能够编码蛋白质的编都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非码区和具有调控作用的非编码区组成的编码区组成的第5页/共35页基因的种类基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。调节基因。（2）没有转译产物的基因：如）没有转译产物的基因：如rRNA基因基因和和tRNA基因。基

4、因。（3）不能转录的）不能转录的DNA片段：如操纵基因。片段：如操纵基因。第6页/共35页启动子与终止子启动子与终止子 启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。 终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。第7页/共35页基因工程的基本操作流程基因工程的基本操作流程第8页/共35页基因组文库和部分基因文库基因组文库和部分基因文库基因组文库部分基因文库第9页/共35页基因组文库和部分基因文库基因组文库

5、和部分基因文库第10页/共35页cDNA合成过程合成过程 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 第11页/共35页利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。第12页/共35页获取目的基因获取目的基因从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成第13页/共35页构建表达载体

6、构建表达载体表达载体的组成1. 目的基因2. 启动子3. 终止子4. 标记基因第14页/共35页基因工程载体的构建需要考虑哪些因素基因工程载体的构建需要考虑哪些因素 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因

7、产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。 第15页/共35页转化转化: :目的基因目的基因进入受体细胞内进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持，并且在受体细胞内维持稳定和稳定和表达表达的过程。的过程。3、将目的基因导入受体细胞受体细胞种类受体细胞种类方法方法植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法（双子叶植物、裸子植物）基因枪法（单子叶植物）花粉管通道法显微注射技术：目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物用CaCa2+2+

8、处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNADNA分子第16页/共35页将目的基因导入受体细胞（植物细胞）将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法第17页/共35页思考：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?要选择要选择合适的农杆菌菌株合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤

9、部位靠拢（趋化目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。第18页/共35页 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。第19页/共35页将目的基因导入受体细胞（动物细胞）将目的基因导入受体细胞（动物细胞） 显微注射法第20页/共35页将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）将目的基因导入受体细胞（微生物细胞） C

10、a2+处理第21页/共35页四、目的基因的检测与鉴定1、检测与鉴定的目的目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上2、检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质另外：个体生物学水平的鉴定第22页/共35页知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中

11、的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。第23页/共35页思考：检测mRNA 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？#检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交#个体生物学水平的鉴定第24页/共35页归纳归纳: 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因u从基因文库u利用PCRPCRu化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译第25页/共35页第26页/共35页基因操作的基本

12、步骤基因操作的基本步骤第27页/共35页基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤第28页/共35页原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的编码区下游的DNA序列，虽不序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等序列，如启动子、终止子等第29页/共35页基因组文库和部分基因文库基因组文库和部分基因文库第30页/共35页获取目的基因获取目的基因从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成第31页/共35页获取目的基因获取目的基因从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成第32页/共35页四、目的基因的检测与鉴定1、检测