生物化学实验技术电泳技术PPT课件

1、第1页/共94页第2页/共94页第3页/共94页第4页/共94页第5页/共94页 二、电泳技术的基本原理和分类二、电泳技术的基本原理和分类 1. 1. 基本原理基本原理 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。FQE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律， 即：F6r式中r为质点半径，为介质粘度，为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：FF即QE6r =QE/6r 可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳

2、迁移率。第6页/共94页 2.2.分类及优点分类及优点 电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。 自由电泳自由电泳包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。 区带电泳区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。 自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。第7页/共94页3. 3. 影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素 电场强度

3、电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/20cm10V/cm。当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。第8页/共94页 溶液的溶液的pHpH值值 溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团（-COOH），又有碱性基团（-NH

4、2）的两性电解质，在某一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再移动，溶液的这一pH值为该蛋白质的等电点（isoelctric point，pI）。若溶液pH处于等电点酸侧，即pHpl，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pH处于等电点碱侧，即pHpl，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。第9页/共94页 溶液的离子强度溶液的离子强度 电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相

5、反的离子氛（ionic atmosphere），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度表示。第10页/共94页 电渗电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负

6、极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。第11页/共94页第二节第二节 电泳分析常用方法电泳分析常用方法 （一）醋酸纤维素薄膜电泳（一）醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5g的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别

7、适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。第12页/共94页材料与试剂材料与试剂 醋酸纤维素膜一般使用市售商品，常用的电泳缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液，浓度0.05-0.09mol/L。操作要点操作要点 膜的预处理：必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液，浸透后，取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。 加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析，每cm加样线不超过1l，相当于60-80g的蛋白质。 电泳：可在室温下进行。电压为25V/c

8、m，电流为0.4-0.6mA/cm宽。 染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。 脱色与透明：对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：无水乙醇30:70（V/V）的透明液中。第13页/共94页（二）琼脂糖凝胶电泳（二）琼脂糖凝胶电泳 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶

9、孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。 第14页/共94页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中常用于LDH（乳酸脱氢酶）、CK（肌酸激酶）等同工酶的检测。第15页/共94页 琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反

10、比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA直线DNA开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。 设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。 核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/L TrisHCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L TrisHCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mo

11、l/L EDTA）。第16页/共94页 凝胶制备：凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5-0.8琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5g/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。 样品制备与加样样品制备与加样：溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料（0.025溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10-15）或甘油（5-10），每齿孔可加样5-10g。 电泳电泳：一般电压为5-15V/cm。对大分子的分离可用电压5V

12、/cm。电泳过程最好在低温条件下进行。第17页/共94页 样品回收：样品回收： 电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收，如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶，将其装入透析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液），扎紧透析袋后，平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中，100V电泳2-3小时，然后正负电极交换，反向电泳2分钟，使透析袋上的DNA释放出来。吸出含DNA的溶液，进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。 其它还有低融点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等，但各种方法都仅仅有利于小分子量DNA片段（1kb的回收，

13、随着DNA分子量的增大，回收量显著下降。第18页/共94页3. 3. 琼脂糖电泳应用琼脂糖电泳应用 （1） 核苷酸琼脂糖电泳 （2） 血清脂蛋白电泳 （3） EcoR1对DNA酶解片段分析第19页/共94页（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳 优点：优点： 可调节孔径大小，机械强度好，无电渗，分辨率高，用途广。可调节孔径大小，机械强度好，无电渗，分辨率高，用途广。 一、基本原理一、基本原理 浓度浓度 T%=(a+b)/mT%=(a+b)/m* *100%100% 交联度交联度 C%=b/(a+b)C%=b/(a+b) 聚合过程聚合过程 AP-TEMEDAP-TEMED 核黄素核黄素

14、- -TEMEDTEMED第20页/共94页第21页/共94页第22页/共94页样品分子量范围凝胶浓度%蛋白质10420301-410415204104 -11051015105 -5105510510525核酸1041520104 -105510105 210622.6选择聚丙烯酰胺浓度参考表第23页/共94页 二、操作二、操作 试剂 (1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。 (2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过

15、，置棕色瓶内，在冰箱中保存。 (3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。 (4)溴酚蓝指示液 取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90乙醇5ml,微热使溶解，加20乙醇制成250ml。 (5)染色液 取0.25(W/V)考马斯亮蓝G溶液2.5ml，加12.5(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。 (6)稀染色液 取上述染色液2ml，加12.5(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。 (7)脱色液 7醋酸溶液。 第24页/共94页 操作操作 (1)制胶 取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加

16、尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡， 加0.56过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(100.5cm)中,使胶层高度达67cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。 (2)标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。 (3)电泳 将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50100l，为防止扩散可加甘油或40蔗糖溶液12滴及0.04溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上

17、部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为23mA，当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。 (4)染色和脱色 电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑出，将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡1030分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。 (5)结果判断 将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。进胶端到溴酚蓝区带的距离 扫描 将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分，由各组分的峰面积计算百分含量。第25页/共94

18、页三、常用几种染色三、常用几种染色 蛋白质蛋白质 1.1. 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250 2.2. 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250 3.3. 氨基黑氨基黑 4.4. 过碘酸过碘酸- -schiffschiff试剂试剂 5.5. 氨基萘酚磺酸氨基萘酚磺酸 6.6. 银染色剂银染色剂 核酸核酸 1.1. 甲基绿甲基绿 2.2. 焦宁焦宁Y Y 3.3. 溴化乙锭溴化乙锭( (EBEB）第26页/共94页第27页/共94页四、四、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量

19、比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(Rf)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。 LogM=a-bRf 第28页/共94页第29页/共94页 1.1. 相对迁移率和分子量计算相对迁移率和分子量计算 将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量、蛋白移动距离。按下式计算相对迁移率： 相对迁移率(Rf)蛋白移动的距离/染料移动的前沿距离 以Rf为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上绘图,由标准曲线中查出供试品分子量。 第3

20、0页/共94页葡糖苷酸酶 葡糖苷酸酶第31页/共94页SDS-PAGE第32页/共94页五、等电聚焦电泳技术五、等电聚焦电泳技术 等电聚焦（等电聚焦（isoelectric focusingisoelectric focusing，IEFIEF）是是6060年代中期问世的一种利用有年代中期问世的一种利用有pHpH梯度的介质分梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达辨率可达0.010.01pHpH单位，因此特别适合于分离分单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。子量相近而等电点不同的蛋白质组分。第33页/共94页 1

21、. 1.等电聚焦技术必需的物质是两性电解质等电聚焦技术必需的物质是两性电解质。 在支持物（聚丙烯酰胺或琼脂糖）中，必须要有在支持物（聚丙烯酰胺或琼脂糖）中，必须要有一个稳定的线性的一个稳定的线性的pHpH梯度，形成这一线性梯度，形成这一线性pHpH梯度梯度的物质就是两性载体。的物质就是两性载体。RllbeRllbe早期发现谷氨酸、组氨早期发现谷氨酸、组氨酸和赖氨酸均能产生大约酸和赖氨酸均能产生大约1 1pHpH的梯度，但的梯度，但pHpH范围太范围太窄，且缓冲能力不够，因为蛋白质分子本身也是两窄，且缓冲能力不够，因为蛋白质分子本身也是两性电解质，在电泳时，会影响梯度性电解质，在电泳时，会影响梯

22、度pHpH值，为此，值，为此，要求形成要求形成pHpH梯度的物质必须有足够的缓冲能力来梯度的物质必须有足够的缓冲能力来克服蛋白质的影响。另外，还要求两性载体电解质克服蛋白质的影响。另外，还要求两性载体电解质必须有一个好的、均匀的导电性，使其整体系中保必须有一个好的、均匀的导电性，使其整体系中保持电流畅通。持电流畅通。第34页/共94页 1966 1966年年VesterbergVesterberg合成了一种两性载体物质，即合成了一种两性载体物质，即由许多脂肪族的多羧基多氨基的异构体和同系物组由许多脂肪族的多羧基多氨基的异构体和同系物组成的混合体，利用调节胺和酸的比例可得到含氨基成的混合体，利用

23、调节胺和酸的比例可得到含氨基与羧基不同比例的脂肪族多氨基多羧基。两性电解与羧基不同比例的脂肪族多氨基多羧基。两性电解质的质的pIpI值将在大多数羧基的值将在大多数羧基的pKpK值和大多数氨基的值和大多数氨基的pKpK值之间，多乙烯多胺链愈长，两性电解质的值之间，多乙烯多胺链愈长，两性电解质的pIpI值也值也越连续，即可获得平滑的越连续，即可获得平滑的pHpH梯度。如图所示。梯度。如图所示。 载体两性电解质，分子量在载体两性电解质，分子量在30030010001000之间，其之间，其pKpK和和pIpI值各不相同但相互接近，值各不相同但相互接近，pHpH范围在范围在2.52.51111之间，有之

24、间，有pHpH范围不同的各类载体两性电解质，瑞典范围不同的各类载体两性电解质，瑞典LKBLKB公司的商品名称为公司的商品名称为“AmpholineAmpholine”。第35页/共94页 2. 2.两性载体必须具备下述条件：两性载体必须具备下述条件： （1 1）较强的缓冲能力及可溶性：聚焦过程中，为了）较强的缓冲能力及可溶性：聚焦过程中，为了防止蛋白质引起防止蛋白质引起pHpH梯度的梯度的pHpH局部改变，保持局部改变，保持pHpH梯梯度的稳定，两性载体必须具有较强的缓冲能力，特度的稳定，两性载体必须具有较强的缓冲能力，特别是在被分离的蛋白等电点范围的缓冲作用。别是在被分离的蛋白等电点范围的缓

25、冲作用。 （2 2）具有好的均匀导电性：在等电聚焦中，对等电）具有好的均匀导电性：在等电聚焦中，对等电点处必须有足够的电导，并要求各部位是均匀导电，点处必须有足够的电导，并要求各部位是均匀导电，若局部电导过小，有可能产生极大的电压降，局部若局部电导过小，有可能产生极大的电压降，局部发热，不仅影响发热，不仅影响pHpH梯度，且易使蛋白质产生热变性梯度，且易使蛋白质产生热变性作用，使凝胶烧坏。作用，使凝胶烧坏。 （3 3）两性载体本身紫外吸收值低：不与被分析的蛋）两性载体本身紫外吸收值低：不与被分析的蛋白质起化学反应。白质起化学反应。 （4 4）无生物学效应：该物质对组织细胞及抗原的免）无生物学效

26、应：该物质对组织细胞及抗原的免疫性均无影响，也就是说若有少许两性电解质混入疫性均无影响，也就是说若有少许两性电解质混入被分离的蛋白质中，并不影响其任何生物学功能。被分离的蛋白质中，并不影响其任何生物学功能。第36页/共94页IEF IEF 基本原理基本原理 蛋白质是一种两性电解质分子，当它在大于它的蛋白质是一种两性电解质分子，当它在大于它的等电点的等电点的pHpH环境中，就解离成带负电的离子，在电环境中，就解离成带负电的离子，在电场中就泳动到正极；当它在小于它们的等电点的场中就泳动到正极；当它在小于它们的等电点的pHpH环境中，它变解离成带正电荷的离子，在电场中向环境中，它变解离成带正电荷的离

27、子，在电场中向负极泳动，这种泳动作用到达它的等电点的负极泳动，这种泳动作用到达它的等电点的pHpH环境环境中，即它的净电荷为零时才停止，此时带电分子在中，即它的净电荷为零时才停止，此时带电分子在电场作用下的迁移运动与扩散运动达到平衡。如果电场作用下的迁移运动与扩散运动达到平衡。如果在一个在一个pHpH梯度的环境中进行这种两性电解质（如蛋梯度的环境中进行这种两性电解质（如蛋白质）的电泳，由于各种蛋白质的等电点不同，就白质）的电泳，由于各种蛋白质的等电点不同，就能把不同蛋白质的分子按他们的等电点集中和分离能把不同蛋白质的分子按他们的等电点集中和分离在不同的区带中。在不同的区带中。第37页/共94页

28、 图图 蛋白质的分离模式图蛋白质的分离模式图 箭头代表移动方向，箭头长箭头代表移动方向，箭头长短代表移动速度，右图为平衡时蛋白质的分离状态。短代表移动速度，右图为平衡时蛋白质的分离状态。第38页/共94页 现设有等电点不同的载体两性电解质现设有等电点不同的载体两性电解质a a、b b、c c、d d、e e、f f混合液，在电场中泳动，混合液，在电场中泳动，pIpI最低（即最酸的）的最低（即最酸的）的a a（等电点为等电点为pIpIa a）集中在最接近阳极的部位，经浓缩集中在最接近阳极的部位，经浓缩缓冲后，缓冲后，a a处于等电状态（处于等电状态（a a的实际电荷为零），这部的实际电荷为零），

29、这部分分pHpH与与pIpIa a一致。仅高于一致。仅高于a a等电点的等电点的b b（等电点为等电点为PIPIb b）同样向正极电泳，但无法跨越同样向正极电泳，但无法跨越a a接近正极，与接近正极，与a a比较，比较，b b带正电荷，仅停留在带正电荷，仅停留在a a的负极端，这一部位的的负极端，这一部位的pHpH与与pIpIb b一致。同理一致。同理c c停留在停留在b b的负极侧的负极侧，f f在最负极端。在最负极端。经此电泳后，使这许多经此电泳后，使这许多pIpI不同的载体两性电解质形不同的载体两性电解质形成了从正极到负极分别为成了从正极到负极分别为pIpIa a-pI-pIb b- p

30、I- pIc c-pI-pId d- pI- pIe e-pI-pIf f的的pHpH梯度。梯度。第39页/共94页 同时这些载体两性电解质具有足够的缓冲能同时这些载体两性电解质具有足够的缓冲能力，使被分离的电解质不致于影响局部的力，使被分离的电解质不致于影响局部的pHpH值。值。又设有不同等电点的三种蛋白质又设有不同等电点的三种蛋白质A A、B B、C C，在两在两种电极液分别为酸、碱的电场中泳动，种电极液分别为酸、碱的电场中泳动，A A、B B、C C各自向自己等电点相同的各自向自己等电点相同的pHpH部分移动。使电荷部分移动。使电荷消失，停止移动，即消失，停止移动，即A A、B B、C

31、C各自停留在与各自停留在与pIpIA A- -pIpIB B- pI- pIC C相同的相同的pHpH部位，从而达到分离蛋白质部位，从而达到分离蛋白质A A、B B、C C的目的，如图所示。本方法装置简单，分的目的，如图所示。本方法装置简单，分辨力强，分离效果及重复性好，即可用于分离精辨力强，分离效果及重复性好，即可用于分离精制，也可作分析用，对标本纯度要求不严，但必制，也可作分析用，对标本纯度要求不严，但必须无盐存在。须无盐存在。第40页/共94页图 平衡时载体两性电解质的浓度分布与pH梯度 第41页/共94页IEF分离 在等电聚焦中，分离仅仅决定于蛋白质等电点，在等电聚焦中，分离仅仅决定于

32、蛋白质等电点，这是一个这是一个“稳定稳定”过程，一旦蛋白质到达他的等电过程，一旦蛋白质到达他的等电点位置，失去净电荷，该蛋白质就不能进一步迁移点位置，失去净电荷，该蛋白质就不能进一步迁移停留在与某一蛋白停留在与某一蛋白pIpI相同的相同的pHpH值位置。等电聚点的值位置。等电聚点的最大优点是具有浓缩效应（或称为聚焦效应），可最大优点是具有浓缩效应（或称为聚焦效应），可以对抗扩散，因此可以产生细窄稳定的蛋白区带。以对抗扩散，因此可以产生细窄稳定的蛋白区带。在这种电场中，蛋白质即使会扩散，由于是处于等在这种电场中，蛋白质即使会扩散，由于是处于等电聚焦系统中，电极之间的电聚焦系统中，电极之间的pHp

33、H梯度也是线性和连续梯度也是线性和连续的。如果蛋白带向阴极扩散，则将进入高的。如果蛋白带向阴极扩散，则将进入高pHpH范围而范围而带负电荷，阳极就将吸引它回去，直到它回到净电带负电荷，阳极就将吸引它回去，直到它回到净电荷是零的位置。如果它向阳极扩散，则将带正电，荷是零的位置。如果它向阳极扩散，则将带正电，阴极将吸引它回到净电荷是零的位置。因此蛋白质阴极将吸引它回到净电荷是零的位置。因此蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的区只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的区带，如图所示。带，如图所示。第42页/共94页图 IEF-PAGE图（平板电泳） 第43页/共94页 3.3.等电点分

34、离包括三个步骤：等电点分离包括三个步骤： 载体两性电解质在电场中形成载体两性电解质在电场中形成pHpH梯度；梯度； 两性电解质（如蛋白质）经电泳分离停留在两性电解质（如蛋白质）经电泳分离停留在不同的不同的pHpH区域；区域； 被分离的两性电解质的鉴定和等电点（被分离的两性电解质的鉴定和等电点（pIpI）的测定。的测定。第44页/共94页 4. 两性电解质载体两性电解质载体pHpH范围及用量选择范围及用量选择 常用的常用的pHpH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。胶为最常应

35、用。 电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合，因此应的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在先将凝胶浸泡在5 5的三氯醋酸中去除两性电解的三氯醋酸中去除两性电解质，然后再以适当的方法染色。质，然后再以适当的方法染色。第45页/共94页六、固相pH梯度等电聚焦电泳 固相pHpH梯度等电聚焦( (immobilized pH gradients immobilized pH gradients isoelectric focusingisoelectric focusing，IPGIEF)IPGIEF) 是80

36、80年代建立起来的一种新型等电聚焦技术。其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，它们与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有相似的聚合行为。如PharmaciaPharmacia公司的固定化电解质( (immobiline)immobiline)。 固定化电解质一端的双键可以在聚合中共价结合到聚丙烯酰胺介质中；其另一端的R R基团为弱酸或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系。所以固相pHpH梯度与载体两性电解质pHpH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pHpH梯度，不随环境电场条件的改变而改变；后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pHpH梯度。IPG

37、IEFIPGIEF比传统的IEFIEF具有更高的分辨率，更大的上样量。其分辨率可达0 0001001pHpH。是目前分辨率最高的电泳方法之一. .第46页/共94页固相pH梯度的优缺点 固相pH梯度可窄至pH0.1的范围，因此其分辨率极高，可达0.001pH；pH梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选择PH梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干扰小；对碱性蛋白质也能很好地分离；无边缘效应，故可用很窄的胶条(如5mm宽)聚焦，特别适合于双相电泳的第一相。但固相pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯酰胺凝胶，电泳时需高电压，电泳时间长，窄范围pH测定困难，只能计算。第47页/共94页六、其他电

38、泳技术六、其他电泳技术 IEF/SDS-PAGEIEF/SDS-PAGE双向电泳法双向电泳法 19751975年年OFarrallOFarrall等人根据不同组份之间的等电点等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了差异和分子量差异建立了IEF/SD S-PAGEIEF/SD S-PAGE双向电泳。双向电泳。其中其中IEFIEF电泳（管柱状）为第一向，电泳（管柱状）为第一向，SDS-PAGESDS-PAGE为第为第二向（平板）。在进行第一向二向（平板）。在进行第一向IEFIEF电泳时，电泳体系电泳时，电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂N

39、P-40NP-40。蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展。以促使蛋白质变性和肽链舒展。 IEFIEF电泳结束后，将圆柱形凝胶在电泳结束后，将圆柱形凝胶在SDS-PAGESDS-PAGE所所应用的样品处理液（内含应用的样品处理液（内含SDSSDS、-巯基乙醇）中振荡巯基乙醇）中振荡平衡，然后包埋在平衡，然后包埋在SDS-PAGESDS-PAGE的凝胶板上端，即可进的凝胶板上端，即可进行第二向电泳。行第二向电泳。 IEF/ SDS-PAGEIEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质（包括核糖双向电泳对蛋白质（包括核糖

40、体蛋白、组蛋白等）的分离是极为精细的，因此特别体蛋白、组蛋白等）的分离是极为精细的，因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。第48页/共94页2D gel第49页/共94页蛋白质分析第50页/共94页第51页/共94页第52页/共94页第53页/共94页第54页/共94页第55页/共94页第56页/共94页第57页/共94页第58页/共94页第59页/共94页毛细管电泳毛细管电泳 NeuhoffNeuhoff等人于等人于19731973年建立了毛细管均一浓度和年建立了毛细管均一浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的方法，即微柱梯度浓度凝胶用来分析

41、微量蛋白质的方法，即微柱胶电泳，均一浓度的凝胶是将毛细管浸入凝胶混合胶电泳，均一浓度的凝胶是将毛细管浸入凝胶混合液中，使凝胶充满总体积的液中，使凝胶充满总体积的2/32/3左右，然后将其揿入左右，然后将其揿入约厚约厚2mm2mm的代用粘土垫上，封闭管底，用一支直径的代用粘土垫上，封闭管底，用一支直径比盛凝胶的毛细管更细的硬质玻璃毛细管吸水铺在比盛凝胶的毛细管更细的硬质玻璃毛细管吸水铺在凝胶上。聚合后，除去水层并用毛细管加蛋白质溶凝胶上。聚合后，除去水层并用毛细管加蛋白质溶液（液（0.1-1.0l0.1-1.0l，浓度为，浓度为1-3mg/ml1-3mg/ml）于凝胶上，毛细）于凝胶上，毛细管的

42、空隙用电极缓冲液注满，切除插入粘土部分，管的空隙用电极缓冲液注满，切除插入粘土部分，即可电泳。即可电泳。第60页/共94页 目前毛细管电泳分析仪的诞生，特别是美国生目前毛细管电泳分析仪的诞生，特别是美国生物系统公司的高效电泳色谱仪为物系统公司的高效电泳色谱仪为DNADNA片段、蛋白片段、蛋白质及多肽等生物大分子的分离、回收提供了快速、质及多肽等生物大分子的分离、回收提供了快速、有效的途径。有效的途径。 高效电泳色谱法是将凝胶电泳解析度和快速液高效电泳色谱法是将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体，在从凝胶中洗脱样品时，连相色谱技术溶为一体，在从凝胶中洗脱样品时，连续的洗脱液流载着分离好的成

43、分，通过一个连机检续的洗脱液流载着分离好的成分，通过一个连机检测器，将结果显示并打印记录。高效电泳色谱法既测器，将结果显示并打印记录。高效电泳色谱法既具有凝胶电泳固有的高分辨率，生物相容性的优点，具有凝胶电泳固有的高分辨率，生物相容性的优点，又可方便地连续洗脱样品。又可方便地连续洗脱样品。第61页/共94页（一）、毛细管电泳技术（一）、毛细管电泳技术(capillary (capillary electrophoresis, CE)electrophoresis, CE)的发展简史的发展简史 19811981年年 JorgensonJorgenson和和LukacsLukacs创立现代毛细管创

44、立现代毛细管电泳电泳 19841984年年 TerabeTerabe建立毛细管胶束电动色谱建立毛细管胶束电动色谱 19871987年年 Hjerten Hjerten 建立毛细管等电聚焦建立毛细管等电聚焦 CohenCohen和和KargerKarger建立毛细管凝胶电泳建立毛细管凝胶电泳 1988-19891988-1989年年 第一代毛细管电泳仪问世第一代毛细管电泳仪问世第62页/共94页（二）、（二）、CECE的基本原理的基本原理 CECE是一种以高压电场为驱动力，以毛细管为是一种以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品中组分的浓度和分配行为差分离通道，根据样品中组分的浓度和分配

45、行为差异进行分离的一种液相分离技术。异进行分离的一种液相分离技术。第63页/共94页 分离模式分离模式 （1 1）毛细管区带电泳毛细管区带电泳(capillary zone (capillary zone electrophoresis, CZE)electrophoresis, CZE)亦称为毛细管自由电泳，是亦称为毛细管自由电泳，是CECE中最基本、应用最普遍的一种模式。中最基本、应用最普遍的一种模式。CZECZE分离多肽分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电性决类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电性决定，比传统凝胶电泳更准确。目前存在于定，比传统凝胶电泳更准确。目前存在于C

46、ZECZE分离分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛细分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛细管硅胶柱上的硅醇发生反应，影响峰形与电泳时间，管硅胶柱上的硅醇发生反应，影响峰形与电泳时间，针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进，如针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进，如调节电池泳液的调节电池泳液的PHPH值，使与硅醇反应的极性基团减值，使与硅醇反应的极性基团减少；改进毛细管柱材料的组成，针对多肽性质的不少；改进毛细管柱材料的组成，针对多肽性质的不同采取不同的同采取不同的CZECZE方法研究分离方法研究分离5 5个含个含9 9个氨基酸残个氨基酸残基的小肽，确定了小肽分析的基本条件

47、，即在低基的小肽，确定了小肽分析的基本条件，即在低PHPH条件下，缓冲液中含有一定浓度的金属离子如条件下，缓冲液中含有一定浓度的金属离子如ZnZn2+2+等，此时分离速度快而且准确。等，此时分离速度快而且准确。第64页/共94页 （2 2）胶束电动毛细管色谱）胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)capillary chromatography, MECC)。 MECCMECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如SDS

48、SDS，使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。，使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。特别对一些小分子肽，阴离子、阳离子表面活性剂特别对一些小分子肽，阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束，从而得的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束，从而得到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环糊精等物质，可使仅含疏水结构组分的多肽选择性糊精等物质，可使仅含疏水结构组分的多肽选择性与环糊精的环孔作用，从而利用疏水作用使多肽得与环糊精的环孔作用，从而利用疏水作用使多肽得到分离。到分离。第65页/共94页 （3 3）毛细管凝胶电泳）毛细管凝胶电

49、泳(capillary gel (capillary gel electrophoresis, CGE)electrophoresis, CGE) 是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。泳。 C G EC G E 是 基 于 分 子 筛 原 理 ， 经 十 二 烷 基 磺 酸 钠是 基 于 分 子 筛 原 理 ， 经 十 二 烷 基 磺 酸 钠（SDSSDS）处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠）处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离。目前，又有一种分子形状、分子量不同而分离。目前，又有一种非交联、线性、疏水多聚凝胶柱被用于

50、多肽物质非交联、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽物质的分离分析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽的分离分析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离，这种凝胶易于灌注，使用寿命长，性质较分离，这种凝胶易于灌注，使用寿命长，性质较为稳定。为稳定。第66页/共94页 (4)(4)毛细管等电聚集毛细管等电聚集(capillary isoelectric focusing, (capillary isoelectric focusing, CIEF)CIEF)将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。 由于不同的蛋白、多肽的等电点（由于不同的蛋白、多肽的等电点（PIPI）不同，

51、因）不同，因此在具有不同此在具有不同pHpH梯度的电泳槽中，其可在等电点梯度的电泳槽中，其可在等电点pHpH条件下聚集沉淀下来，而与其他肽类分离开来。条件下聚集沉淀下来，而与其他肽类分离开来。CIEFCIEF在分离、分析混合多肽物质中应用不多，主要在分离、分析混合多肽物质中应用不多，主要应用与不同来源的多肽异构体之间的分离，如对应用与不同来源的多肽异构体之间的分离，如对rHGrHG不同异构体分离。由于在不同异构体分离。由于在CIEFCIEF柱表面覆盖物的柱表面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用。不稳定性限制了此法的广泛应用。第67页/共94页 （5 5）毛细管等速电泳毛细管等速电泳(capi

52、llary isotachorphoresis, (capillary isotachorphoresis, CITP)CITP)采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳速度不同得到分离。泳速度不同得到分离。 （6 6）毛细管电色谱毛细管电色谱(capillary (capillary electrochromatography, CEC)electrochromatography, CEC)是将是将HPLCHPLC中的固定中的固定相微粒填充到毛细管中，以样品和固定相之间的相互相微粒填充到毛细管中，以样品和固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动

53、相驱动力的色谱过作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。程。第68页/共94页 （三）、（三）、CECE仪仪 CECE仪的组成：高压电源、毛细管、检测器、缓冲液贮液瓶仪的组成：高压电源、毛细管、检测器、缓冲液贮液瓶第69页/共94页 1.CE1.CE柱技术柱技术 毛细管是毛细管是CECE的核心部件，研究的内容涉及毛细的核心部件，研究的内容涉及毛细管直径、长度、形状和材料等方面。一般长度管直径、长度、形状和材料等方面。一般长度20-20-70cm70cm，内径为，内径为25-100m25-100m。毛细管形状：圆形、。毛细管形状：圆形、矩形、扁方形。制作材料有：聚丙烯空心纤维、聚矩形、

54、扁方形。制作材料有：聚丙烯空心纤维、聚四氟乙烯、玻璃、石英。熔融硅胶四氟乙烯、玻璃、石英。熔融硅胶( (石英石英) )毛细管最毛细管最常用。为克服毛细管内壁对生物大分子的吸附，可常用。为克服毛细管内壁对生物大分子的吸附，可以采用以下策略：以采用以下策略： 改变缓冲液改变缓冲液pHpH和离子强度，抑制硅醇基的解离。和离子强度，抑制硅醇基的解离。 在缓冲液中加入添加剂，使其在内壁形成一动在缓冲液中加入添加剂，使其在内壁形成一动态吸附层态吸附层( (物理吸附物理吸附) )。 采用化学衍生或化学键合方法在内壁形成一涂采用化学衍生或化学键合方法在内壁形成一涂渍层。渍层。第70页/共94页 理想涂层的条件

55、：理想涂层的条件： 1)1) 在较宽的酸度范围内能长时间保在较宽的酸度范围内能长时间保持稳定。持稳定。 2)2) 与被分离的物质不发生化学反应。与被分离的物质不发生化学反应。 3) 3) 具有一定的亲水性并能够有效地具有一定的亲水性并能够有效地抑制蛋白质的吸附。抑制蛋白质的吸附。 4) 4) 能够保持一定的电渗流。能够保持一定的电渗流。 5)5) 制作方法简单、易操作、重复性制作方法简单、易操作、重复性好。好。第71页/共94页 2. 2.检测器检测器 紫外检测器紫外检测器 荧光检测器：普通荧光检测器、激光诱荧光检测器：普通荧光检测器、激光诱导荧光检测器导荧光检测器(LIF)(LIF) 质谱检

56、测器：质谱检测器：CE-MSCE-MS 电化学检测器：电导检测器、安培检测电化学检测器：电导检测器、安培检测器器 激光检测器：激光检测器：LIFLIF、激光热透镜检测器、激光热透镜检测器、激光诱导毛细管振动检测激光诱导毛细管振动检测 器、激光拉曼器、激光拉曼光谱检测器光谱检测器 其它：折射率检测器、同位素检测器、其它：折射率检测器、同位素检测器、激光圆二色检测器激光圆二色检测器第72页/共94页 3.CE3.CE的进样技术的进样技术 进样方式：微量注射器、进样阀、电分流、扩进样方式：微量注射器、进样阀、电分流、扩散进样、电迁移进样、液体动力学进样。散进样、电迁移进样、液体动力学进样。 进样技术

57、进展：进样技术进展： 1)1)直接在线进样直接在线进样 2)CE2)CE与其它分析技术联用的进样问题与其它分析技术联用的进样问题 a.CEa.CE与流动注射分析联用与流动注射分析联用(CE-FI)(CE-FI) b.b.液相色谱与液相色谱与CECE联用联用(CE-HPLC)(CE-HPLC) c.c.用于相关毛细管电泳的进样技术用于相关毛细管电泳的进样技术 d.d.用于微量及单个分子的进样用于微量及单个分子的进样 e.e.近端进样及双向进样近端进样及双向进样第73页/共94页 4.CE4.CE的最新进展及有关学术问题的最新进展及有关学术问题 非水介质毛细管电泳非水介质毛细管电泳(Non-aqu

58、eous CE)(Non-aqueous CE) 集成毛细管电泳芯片技术集成毛细管电泳芯片技术(integrated capillary (integrated capillary electrophoresis chips)electrophoresis chips) 从从 1 9 9 01 9 9 0 年 起 每 年 举 行 一 届年 起 每 年 举 行 一 届 I n t e r n a t i o n a l I n t e r n a t i o n a l Symposium on HPEC,Symposium on HPEC, “Analytical ChemistryAnaly

59、tical Chemistry”每两年刊出一每两年刊出一 篇篇CECE综综述。述。 国内的国内的CECE研究单位：大连化学物理研究所、兰研究单位：大连化学物理研究所、兰州化学物理研究所、清华大学生命科学工程学院州化学物理研究所、清华大学生命科学工程学院等。等。第74页/共94页（四）、（四）、CECE在医药学中的应用在医药学中的应用 1.CE1.CE在药学中的应用在药学中的应用 1)1)药物分析：主药成分分析、相关杂质检测、药物分析：主药成分分析、相关杂质检测、药物计量离子配比测定、定量分析。药物计量离子配比测定、定量分析。 2)2)中药成分分析：各类药效成分分析，中药材中药成分分析：各类药效

60、成分分析，中药材中主要成分分析、中药复方制剂成分分析。中主要成分分析、中药复方制剂成分分析。 3)3)药物手性对映体的分析药物手性对映体的分析 4)4)生物工程药物的分析生物工程药物的分析第75页/共94页 2.CE2.CE在医学中的应用在医学中的应用 1)1)临床化学中的应用临床化学中的应用 CECE在医学中的应用涉及的样品有：尿、血、在医学中的应用涉及的样品有：尿、血、脑脊液、细胞、组织、其它体液、动物活体。分脑脊液、细胞、组织、其它体液、动物活体。分析的对象有肽、蛋白质、病毒、酶、糖、析的对象有肽、蛋白质、病毒、酶、糖、DNADNA、小的生物活性分子、离子、药物及其代谢产物。小的生物活性