基础生物化学酶课件

1、123The Nobel Prize in Chemistry 19074The Nobel Prize in Chemistry 1946 Sumner Stanley Northropfor their preparation of enzymes and virus proteins in a pure form for his discovery that enzymes can be crystallized 1/2 of the prize 1/4 of the prize 1/4 of the prize56是活细胞合成的、对其特异是活细胞合成的、对其特异的底物起高效催化作用的的

2、底物起高效催化作用的。是近年来发现的对是近年来发现的对RNA具有高效特异催化作用的具有高效特异催化作用的，其作用主要，其作用主要参与参与RNA的剪接。的剪接。具有催化活性的具有催化活性的78 铂：催化许多反应，包括有机反应铂：催化许多反应，包括有机反应 H+：淀粉、脂肪、蛋白质、蔗糖等：淀粉、脂肪、蛋白质、蔗糖等 酶：作用于结构近似的分子，甚至只催化一种化酶：作用于结构近似的分子，甚至只催化一种化合物合物9n专一性主要取决于酶的专一性主要取决于酶的活性中心活性中心的构象和性的构象和性质质101112131415L(+)乳酸通过其不对称乳酸通过其不对称C原子上的原子上的CH3、COOH及及OH基

3、分别与乳酸脱氢酶活性中心的基分别与乳酸脱氢酶活性中心的A、B及及C三个三个功能基团结合，故可受酶催化而转变为丙酮酸。功能基团结合，故可受酶催化而转变为丙酮酸。D(-)乳酸由于乳酸由于OH、COOH的空间位置与的空间位置与L(+)乳酸相乳酸相反，与酶的三个结合基团不能完全配合，故不能与反，与酶的三个结合基团不能完全配合，故不能与酶结合受其催化。酶结合受其催化。16171819 生物活性仅决定于蛋白质部分生物活性仅决定于蛋白质部分 由蛋白质和非蛋白质部分组成的酶由蛋白质和非蛋白质部分组成的酶 非蛋白部分一般是有机小分子化合物非蛋白部分一般是有机小分子化合物或金属离子，称为辅因子或金属离子，称为辅因

4、子202122n金属酶金属酶(metalloenzyme) 金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失n金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密紧密n金属离子的作用金属离子的作用 参与催化反应，传递电子；参与催化反应，传递电子； 在酶与底物间起桥梁作用；在酶与底物间起桥梁作用； 稳定酶的构象；稳定酶的构象； 中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。 23小分子有机化合物在催化中的作用小分子有机化合物在催化中的

5、作用尼尼克克酰酰胺胺（维维生生素素PP之之一一）尼尼克克酰酰胺胺（维维生生素素PP之之一一）维维生生素素B2（核核黄黄素素）维维生生素素B2（核核黄黄素素）维维生生素素B1（硫硫胺胺素素）泛泛酸酸硫硫辛辛酸酸维维生生素素B12生生物物素素吡吡哆哆醛醛（维维生生素素B6之之一一）叶叶酸酸NAD+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸，辅辅酶酶I）NADP+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸磷磷酸酸，辅辅酶酶II）FMN （黄黄素素单单核核苷苷酸酸）FAD（黄黄素素腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸）TPP（焦焦磷磷酸酸硫硫胺胺素素）辅辅酶酶A（CoA）硫硫辛辛酸酸钴钴胺胺素素辅辅酶

6、酶类类生生物物素素磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛四四氢氢叶叶酸酸氢氢原原子子（质质子子）醛醛基基酰酰基基烷烷基基二二氧氧化化碳碳氨氨基基甲甲基基、甲甲烯烯基基、甲甲炔炔基基、甲甲酰酰基基等等一一碳碳单单位位所所含含的的维维生生素素名名称称小小分分子子有有机机化化合合物物(辅辅 酶酶 或或 辅辅 基基)转转移移的的基基团团尼尼克克酰酰胺胺（维维生生素素PP之之一一）尼尼克克酰酰胺胺（维维生生素素PP之之一一）维维生生素素B2（核核黄黄素素）维维生生素素B2（核核黄黄素素）维维生生素素B1（硫硫胺胺素素）泛泛酸酸硫硫辛辛酸酸维维生生素素B12生生物物素素吡吡哆哆醛醛（维维生生素素B6之之一一）叶叶酸酸NAD

7、+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸，辅辅酶酶I）NADP+（尼尼克克酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸磷磷酸酸，辅辅酶酶II）FMN （黄黄素素单单核核苷苷酸酸）FAD（黄黄素素腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸）TPP（焦焦磷磷酸酸硫硫胺胺素素）辅辅酶酶A（CoA）硫硫辛辛酸酸钴钴胺胺素素辅辅酶酶类类生生物物素素磷磷酸酸吡吡哆哆醛醛四四氢氢叶叶酸酸氢氢原原子子（质质子子）醛醛基基酰酰基基烷烷基基二二氧氧化化碳碳氨氨基基甲甲基基、甲甲烯烯基基、甲甲炔炔基基、甲甲酰酰基基等等一一碳碳单单位位所所含含的的维维生生素素名名称称小小分分子子有有机机化化合合物物(辅辅 酶酶 或或 辅辅 基基)

8、转转移移的的基基团团24252627282930 根据酶所催化的反应类型，按照国际酶学委员根据酶所催化的反应类型，按照国际酶学委员会，将酶分为六大类：会，将酶分为六大类：313233343536乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第第1大类，氧化还原酶大类，氧化还原酶第第1亚类，氧化基团亚类，氧化基团CHOH第第1亚亚类，亚亚类，H受体为受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号该酶在亚亚类中的流水编号3738391. 酶的催化作用及分子活化能酶的催化作用及分子活化能4041Enzyme Stabilizes Transition State SPESESTEPSTReaction

9、directionEnergy changeEnergy required (no catalysis)Energy decreases (under catalysis)Whats the difference?T = Transition state422. 中间产物学说中间产物学说ES+P+In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a cons

10、tant.SEE43443. 酶的活性部位和必需集团酶的活性部位和必需集团4546474. 酶与底物结合形成中间络合物的方式（理论）酶与底物结合形成中间络合物的方式（理论）4.1 锁钥假说锁钥假说(lock and key hypothesis)：484.2诱导契合假说（诱导契合假说（inducedfit hypothesis): 49诱导契合学说的要点诱导契合学说的要点50n邻近效应：邻近效应：在酶促反应中，由于酶和底物分子之间在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中

11、心的最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应有效浓度大大增加的效应n定向效应：定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，同时使反应基团之间的诱导酶分子构象发生改变，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。行。 这两种效应使酶具有高效率和专一性特点这两种效应使酶具有高效率和专一性特点5. 使酶具有高催化效率的因素使酶具有高催化效率的因素5.1 邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应51525.2 “张力张力”和和“变形变形”从而使底物分子某些

12、键的键从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，降低了反应的活化能，能减弱，产生键扭曲，降低了反应的活化能，有助于过渡态的中间产物形成有助于过渡态的中间产物形成53545.3 酸碱催化酸碱催化55n催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化共价催化。n酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团：酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团： His 的咪唑基，的咪唑基，Cys 的巯基，的巯基，Asp 的羧基，的羧基，Ser 的羟基的羟基等；亲

13、电子基团：等；亲电子基团：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+n某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用与共价催化作用 5.4 共价催化共价催化56n 酶活性中心内相对地说是非极性的，也就是说酶酶活性中心内相对地说是非极性的，也就是说酶的催化基团被低介电环境所包围，在某些情况下，的催化基团被低介电环境所包围，在某些情况下，还可能排除高极性的水分子。这样，底物分子的还可能排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，这是有利于酶的加速反应。这是有利于

14、酶的加速反应。5.5 酶活性中心是低介电区域酶活性中心是低介电区域57586. 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶是一个丝氨胰凝乳蛋白酶是一个丝氨酸蛋白酶，活性中心的酸蛋白酶，活性中心的残基：残基：AspAsp102 102 HisHis57 57 SerSer19519559Asp102His57Ser195HHChymotrypsin Catalytic Mechanism A1NCCNHOOCHOCCNCCNH2OCheck substrate specificity60Asp102His57Ser195HHChymotrypsin Catalytic Mechanism A2NCCN

15、HOOCHOCCNCCNH2OFirst Transition State61HHChymotrypsin Catalytic Mechanism A3NCCNHOOCHOCCNCCNH2OAcyl-Enzyme Intermediate62HChymotrypsin Catalytic Mechanism D1N-HCCNHOOCHOCCNCCNH2OHOHAcyl-Enzyme Water Intermediate63HChymotrypsin Catalytic Mechanism D2OOCCNCCNH2HSecond Transition StateOH64HChymotrypsin

16、 Catalytic Mechanism D3OCCNCCNH2OOHDeacylationH6566677. 酶原激活酶原激活68697071酶促反应速度酶促反应速度 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。721. 酶反应速度的测量酶反应速度的测量73742. 酶浓度对酶作用的影响酶浓度对酶作用的影响753. 底物浓度对酶作用的影响和米氏方程底物浓度对酶作用的影响和米氏方程3.1 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响76 Increase Substrate Concentration 2134567800 2 4 6 8Subs

17、trate (mmole)Product806040200S+EP(in a fixed period of time)777879Constant ES Concentration at Steady StateSPEESReaction TimeConcentrationJuang RH (2004) BCbasics803.2 米氏方程米氏方程81Km 米氏常数米氏常数Vmax 最大反应速度最大反应速度82米氏方程的推导：米氏方程的推导：83848586K Km mSS KKm m值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单

18、位是mol/Lmol/L。2 2K Km m + S+ S V Vmaxmax V VmaxmaxSSV VmaxmaxS S K Km m + S + S 873.3 米氏常数米氏常数Km的意义的意义Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。物浓度。8889Km = SKm + S = 2 SVmax2=Vmax SKm + SKm: Affinity with Substrate If vo =Vmax2S2S1S3S1 S2 S3Vmax1/2When using different substrateAffinity changesKm

19、vo =Vmax SKm + S903.4 Km值与值与Vmax值的测定值的测定9192An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)VmaxKmSvo1/S1voDouble reciprocalDirect plot Use predefined amount of Enzyme E Add substrate in various concentrations S (x 軸) Measure Product in fixed Time (P/t) vo (y 軸) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate

20、Vmax When y = 1/2 Vmax calculate x (S) Km1Vmax- 1 Km1/293A Real Example for Enzyme KineticsDatano12340.250.501.02.00.420.720.800.92Absorbancev (mmole/min)S0.210.360.400.46(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmole(2) Reaction time was 10 min VelocitySubstrate ProductDo

21、uble reciprocal1/S1/v4210.52.081.561.351.16 1.00.50vDirect plotDouble reciprocal2.01.001/v-4 -2 0 2 41/S0 1 2S1.0-3.894 例1：下列数据是对酶促反应sp的记录： s(molL-1) v(nmolL-1min-1) 6.2510-6 15.0 7.5010-5 56.25 1.0010-4 60 1.0010-3 74.9 1.0010-2 75 1.0010-1 75 求（1）Vmax和Km (2) s=2.510-5和s=2.0010-1时v等于多大。95 例2：下列数据是对

22、酶促反应sp的记录： s(umolL-1) v(umolmin-1) 0.1 0.27 10.0 20.0 60.0 80.0 200 120 1000 150 1500 160 2000 160 求（1）Vmax和Km (2) s =1600时游离酶的浓度多大？964. pH对酶作用的影响对酶作用的影响97pH影响酶作用的原因：影响酶作用的原因：985. 温度对酶作用的影响温度对酶作用的影响99n最适温度最适温度 (optimum temperature)：100101 贮存生物制品、菌种等贮存生物制品、菌种等 低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。 临床上

23、的低温麻醉临床上的低温麻醉 减少组织细胞的代谢程度，使机体耐受手术时氧和营养物质的缺乏。1026. 激活剂对酶作用的影响激活剂对酶作用的影响103104105n区别于酶的变性区别于酶的变性 抑制剂对酶有一定选择性抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性引起变性的因素对酶没有选择性7. 抑制剂对酶作用的影响抑制剂对酶作用的影响1061071087.1 不可逆性抑制作用不可逆性抑制作用109110 7.2 可逆性抑制作用可逆性抑制作用1117.2.1 竞争性抑制竞争性抑制112113114115116n竞争性竞争性I往往是酶的底物结构类似物；往往是酶的底物结构类似物；n抑制剂与酶的结合

24、部位与底物与酶的结合部抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同位相同 酶的活性中心酶的活性中心n抑制作用可以被高浓度的底物减低以致消除；抑制作用可以被高浓度的底物减低以致消除；n(表观）表观）Km值增大，值增大，Vm值不变；值不变；n在双倒数图上表现为：在双倒数图上表现为： 竞争性抑制和无抑制的直线在纵轴上交于一点；竞争性抑制和无抑制的直线在纵轴上交于一点； 竞争性抑制直线斜率增大；竞争性抑制直线斜率增大； 竞争性抑制直线在横轴上的交点右移；竞争性抑制直线在横轴上的交点右移；1171181197.2.2 非竞争性抑制非竞争性抑制120121122123有非竞争性抑制剂存在时，有非竞争性抑制

25、剂存在时，V值减小值减小(1+I/Ki)倍，倍，且且V值随值随I的增高而降低；的增高而降低；Km值不变。值不变。1241257.2.3 反竞争性抑制反竞争性抑制126127128129130Enzyme Inhibition (Mechanism)IISSSI II II IIISCompetitiveNon-competitiveUncompetitiveEEDifferent siteCompete for active siteInhibitorSubstrateCartoon GuideEquation and Description binds to free E only,and

26、competes with S;increasing S overcomesInhibition by . binds to free E or ES complex; Increasing S cannot overcome inhibition. binds to ES complex only, increasing S favorsthe inhibition by .E + S ES E + P + E E + S ES E + P + + E + S E S E + S ES E + P + E S EISX131KmEnzyme Inhibition (Plots)I IIICo

27、mpetitiveNon-competitiveUncompetitive Direct PlotsDouble ReciprocalVmaxVmaxKmKmS, mMvoS, mMvoKmS, mMVmaxKmVmaxVmaxVmax unchangedKm increasedVmax decreasedKm unchangedBoth Vmax & Km decreased1/S1/Km1/vo1/ VmaxTwo parallellinesIntersect at X axis1/vo1/ Vmax1/S1/Km1/S1/Km1/ Vmax1/vo Intersect at Y

28、axis= Km132133134 一些代谢物可与某些酶一些代谢物可与某些酶变酶的催化活性，变酶的催化活性，此种调节方式称别构调节。此种调节方式称别构调节。 135136137138139TTRTSvoMechanism and Example of Allosteric EffectS SS SRRS SS SRS SAITSvoSvo(+)(-)XXXR = Relax(active)T = Tense(inactive)Allosteric siteHomotropic(+)ConcertedHeterotropic(+)SequentialHeterotropic(-)Concerte

29、dAllosteric siteKineticsCooperationModels(-)(+)(+)Juang RH (2004) BCbasics140141142143144145146147148149150151152153154Turn Over Numbers of EnzymesCatalase H2O2Carbonic anhydrase HCO3-Acetylcholinesterase Acetylcholine40,000,000400,000140,000b-Lactamase Benzylpenicillin2,000Fumarase Fumarate800RecA protein (ATPase) ATP0.4EnzymesSubstratekcat (s-1)The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second155Enzyme Kineticsvo=Vmax