淋巴细胞分离实验ppt课件

1、实验二实验二 小鼠脾脏淋巴细胞的分别小鼠脾脏淋巴细胞的分别 小鼠脾脏淋巴细胞的分别小鼠脾脏淋巴细胞的分别n目的目的 n原理原理n实验步骤实验步骤n本卷须知本卷须知目的目的n熟习淋巴细胞和外周血单个核细胞熟习淋巴细胞和外周血单个核细胞PBMCPBMC的分别方法的分别方法原原 理理n脾脏各种血细胞的密度不尽一样，脾脏各种血细胞的密度不尽一样，利用淋巴细胞分层液利用淋巴细胞分层液FicollFicoll作作密度梯度离心，使一定比重的细胞密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分别。种血细胞加以分别。 原原 理理外周血外周血红细胞红细胞粒细

2、胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板血小板淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞1.0931.0301.0351.0751.090Ficoll：1.0770.001 (PBMC)1.0921500rpm, 20 , 30minPBMC红细胞红细胞粒细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、稀释的血浆、血小板血小板实验步骤实验步骤n1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨研磨同时滴加研磨同时滴加1640培育液，坚持细培育液，坚持细胞活性胞活性 n2. 细胞混合液静置数分钟后吸管汲取，细胞混合液静置数分钟后吸管汲取，沿倾斜的管壁渐渐参与淋巴细胞分层沿倾斜的管壁渐渐参与

3、淋巴细胞分层液上方液上方Ficoll：血细胞：血细胞=1：1实验步骤实验步骤n3.2000r/min，离心，离心15minn4.沿管壁周缘悄然汲取淋巴细胞层移入另一沿管壁周缘悄然汲取淋巴细胞层移入另一试管中试管中实验步骤实验步骤5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min离心5min ，弃上清6. 适量的培育基重悬细胞 ，计数本卷须知本卷须知n1.在在Ficoll上参与稀释外周血时，应缓慢上参与稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面加，以免冲散界面 n2. 汲取单个核细胞层时，应防止吸出过汲取单个核细胞层时，应防止吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染多的上清液或分层液而导致血小板污染细胞计

4、数细胞计数n实验步骤实验步骤n本卷须知本卷须知实验步骤实验步骤n1、预备计数板：、预备计数板：n2、制备细胞悬液：搜集细胞，制成单个细胞、制备细胞悬液：搜集细胞，制成单个细胞悬液悬液n3、加样：用吸管悄然吹打细胞悬液，取少许、加样：用吸管悄然吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，胞悬液，n4、计数：在显微镜下，用、计数：在显微镜下，用10物镜察看计数板物镜察看计数板四角大方格中的细胞数四角大方格中的细胞数n 实验步骤n5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度n 细胞数/毫升原液n =4大格细胞数之和/4104本卷须知n1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液取样计数前，应充分混匀细胞悬液 n2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡气泡n3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 n4.本法要求细胞密度不低于本法要求细胞密度不低于104细胞细胞/mln5.镜下计数时，细胞数过少或过多，阐明稀镜下计数时，细胞数