第四章、第二讲汇总

1、第四章、第二讲第四章、第二讲 4.3 4.3 发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术4.4 4.4 发酵培养基及设备管道发酵培养基及设备管道 灭菌灭菌4.3 发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术 干热灭菌法干热灭菌法 湿热灭菌法湿热灭菌法 射线灭菌法射线灭菌法 化学药剂灭菌化学药剂灭菌法法 过滤除菌法过滤除菌法 火焰灭菌法火焰灭菌法 培养基灭菌的有关理论培养基灭菌的有关理论湿湿热灭菌原理热灭菌原理4.4 发酵培养基及设备管道灭菌发酵培养基及设备管道灭菌（一）加热灭菌原理（一）加热灭菌原理1 1、微生物的热阻、微生物的热阻 每一种微生物都有一定的生长温度范围；每一种微生物都有一定的生长温度范围；

2、当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。 微生物 相对热阻大肠杆菌 1细菌芽孢 3106霉菌孢子 2-10病毒及噬菌体 1-5某些微生物对湿热的相对热阻（与大肠杆菌比较）不同种类微生物对热的抵抗力不同。不同种类微生物对热的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力称为微生物对热的抵抗力称为热阻（heat resistance）。下面介绍与热阻相关的几个概

3、念1）致死温度（Death temperature）杀死微生物的极限温度称为致死温度。杀死微生物的极限温度称为致死温度。2）热力致死时间 (Thermal Death Time; TDT) 在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物所需的最短时间。所需的最短时间。e.g 伤寒杆菌伤寒杆菌58 30min 变形杆菌变形杆菌55 60min2 2、微生物的热死规律、微生物的热死规律对数残留定律对数残留定律 微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。 微生物虽然是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于微生物虽然

4、是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于蛋白质变性所致。蛋白质变性所致。 在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。对数残留定律的概念： 数学表达式：数学表达式：- dN/d = NN 培养基中活的微生物个数；培养基中活的微生物个数； 时间（时间（s）; 比死亡速率比死亡速率（s-1） (死亡速率常数死亡速率常数)dN/d 微生物的瞬间变化率，即死亡速率微生物的瞬间变化率，即死亡速率 对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定亡的速率与残存的微生物

5、数量成正比，这就是对数残留定律。律。 若开始灭菌（ = 0）时，培养基中活的微生物数为N0 = 2.303 logN0/N /- dN/d = NlnN/N0 = - 积分积分2.303logN0/N = or = 2.303 lgN0/N /可见灭菌时间取决于污染程度可见灭菌时间取决于污染程度(N(N0 0) )、灭菌程度、灭菌程度（残留菌数（残留菌数N N）和）和 值值 在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。 灭菌程度，即残留菌数，

6、如果要求完全彻底灭菌，即灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N = N = 0 0，则，则 为为，上式无意义，事实上也不可能。，上式无意义，事实上也不可能。 一般取一般取N = 0.001N = 0.001，即，即10001000次灭菌中有次灭菌中有1 1 次失败。次失败。例： 有一发酵罐内装有一发酵罐内装40m40m3 3培养基，在培养基，在121121温度下进行实罐灭温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每菌。原污染程度为每mlml有有2 210105 5个耐热细菌芽孢，个耐热细菌芽孢， 121121时灭时灭菌速度常数为菌速度常数为1.8min1.8min1 1。求灭菌失败几率为。求灭

7、菌失败几率为0.0010.001时所需的灭时所需的灭菌时间。菌时间。解：解： N0 = 40106 2105 = 8 1012 (个个) N = 0.001; = 1.8 (min1) =2.303 lgN0N=2.3031.8lg(81015)= 20.34 (min)3 3、死亡速率常数、死亡速率常数 （比死亡速率）（比死亡速率） 死亡速率死亡速率 常数常数 是微生物耐热性的一种特征，它随是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。微生物种类和灭菌温度而异。 相同温度下，相同温度下， 值越小，则此微生物越耐热。值越小，则此微生物越耐热。 在在121121，细菌芽孢的，细菌芽孢的

8、 值约为值约为1 1minmin-1 -1, ,而营养细胞的而营养细胞的 值值为为10-1010-101010minmin-1 -1。细菌芽孢名称值 min-1枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌FS5230FS5230硬脂嗜热芽孢杆菌硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518FS1518硬脂嗜热芽孢杆菌硬脂嗜热芽孢杆菌FS617FS617产气梭状芽孢杆菌产气梭状芽孢杆菌PA3679PA36793.8-2.63.8-2.60.770.772.92.91.81.8121某些细菌芽孢的值4、培养基灭菌温度的选择 培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，

9、在加热下氨基酸、维生素等受破坏。成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。 培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。基成分破坏减至最少的条件。 灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残留定律表达式可知）。留定律表达式可知）。 在其它条件不变时，比死亡速率在其它条件不变时，比死亡速率 与温度的关系可用阿仑尼与温度的关系可用阿仑尼乌斯方程式表示。乌斯方程式表示。Svante August Arrhenius was a Swedish physical

10、 chemist best known was a Swedish physical chemist best known for his theory that electrolytes, certain for his theory that electrolytes, certain substances that dissolve in water to yield a substances that dissolve in water to yield a solution that conducts electricity, are solution that conducts e

11、lectricity, are separated, or dissociated, into electrically separated, or dissociated, into electrically charged particles, or ions, even when there is charged particles, or ions, even when there is no current flowing through the solution. In no current flowing through the solution. In 1903 he was

12、awarded the Nobel Prize for 1903 he was awarded the Nobel Prize for Chemistry.Chemistry. = A eR TEArrhenius equationA A 比例常数；比例常数；E E 杀死细菌所需的活化能，杀死细菌所需的活化能，( ( E)E) （4.18 J/mol4.18 J/mol）; ;T T 绝对温度，绝对温度，(K)(K)R R 气体常数，气体常数，1.9781.9784.18 J/(molK)4.18 J/(molK)e 2.71 (exp)e 2.71 (exp) = A eR TElg = +

13、 lgAE2.303RT以以lg lg 对对1/T1/T作图，得一直线，其斜率为作图，得一直线，其斜率为-E/2.303R-E/2.303R，截距为，截距为lgAlgA，从斜率和截距科求得从斜率和截距科求得A A和和E E值。值。1/Tlg 截距 = lgA斜率 = E/2.303R培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：- dC / d = CC 对热不稳定物质的浓度, (mol/L); 分解速率常数 （s1）； 分解反应时间 （s） 随反应物质种类和温度不同随反应物质种类和温度不同在化学反应中，其他条件不变，在化学反应中，其他

14、条件不变， 和温度的关系也可用和温度的关系也可用阿阿仑尼乌斯方程表示：仑尼乌斯方程表示： = A eR TEA A 比例常数；比例常数；E E 分解活化能，分解活化能，( ( E) E) （4.18 J/mol4.18 J/mol）; ;T T 绝对温度，绝对温度，(K)(K)R R 气体常数，气体常数，1.9781.9784.18 J/(molK)4.18 J/(molK)e 2.71 (exp)e 2.71 (exp) 1= A eR T1E 2= A eER T2相除取对数相除取对数ln 2 1= E 1 1R T1 T2 在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数在灭菌时，当温度变化，菌死亡

15、速率常数 和培养基成分破坏速率常数和培养基成分破坏速率常数 都变化。都变化。温度由温度由T T1 1升高到升高到T T2 2， 值分别为：值分别为：同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：ln 2 1 = R T1 T2E 1 1ln( 2 / 1)ln( 2 / 1)EE上面两式相除，得上面两式相除，得由于灭菌的E大于培养基成分分解的E名称E (J/mol)叶酸叶酸泛酸泛酸维生素维生素B12B12维生素维生素B1B1嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌枯草杆菌肉毒梭菌肉毒梭菌70.370.387.987.996.796.792.192.12

16、83283318318343343因此ln 2/ 1ln 2/ 1 即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。 根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时间的方法，有利于减少营养成分的破坏。 灭菌温度/ 灭菌时间/min 维生素B1破坏量/%100 400 99.3110 36 67115 15 50120 4 27130 0.5 8145 0.08 215

17、0 0.01 1（二）影响培养基灭菌的主要因素（二）影响培养基灭菌的主要因素1、微生物热阻 （前述）2、pH 微生物在微生物在pH6.0pH6.08.08.0范围内耐热性最大范围内耐热性最大 pH pH低于低于6.06.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，则所需的杀菌时间愈短。则所需的杀菌时间愈短。影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued） 温度 孢子数 灭菌时间 (min) () (个/ml)pH=6.1 5.3 5.0 4.7

18、4.5120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13110 10000 70 65 35 30 24100 10000 740 720 180 150 150 pH对灭菌时间的影响影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued）3、菌的浓度浓度越高，所需灭菌时间越长浓度越高，所需灭菌时间越长例如： 如肉毒梭状芽孢杆菌，在105湿热灭菌时间芽孢杆菌数芽孢杆菌数/ml /ml 时间时间 (min)(min) 9 910108 8 48 9 48 910106 6 36 936 910104 4 20 20 9 910102 2 14

19、 9 14 9 2 2影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued）4、 培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性 因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的传入。传入。 而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued）5、泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物；中潜伏的微生物； 易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。易产生泡沫的培养基在灭菌时，

20、可加入少量消泡剂。6、颗粒 颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。影响培养基灭菌的主要因素（影响培养基灭菌的主要因素（continued）三、分批灭菌三、分批灭菌（实罐灭菌）（一）操作1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的 分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。 若已先行空罐灭菌，此步可不进行若已先行空罐灭菌，此步可不进行2、 预热向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至7070左右。左右。作用： 利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音有的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量，确

21、保培养基的浓度。3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。4、罐压达1kg/cm2 ( 0.1 MPa)时，按装在发酵罐封 头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。升升 温温 阶阶 段段5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度 保持在一稳定水平，维持一定时间。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保保 温温 阶阶 段段6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内 压力降至0.5kg/cm2左右

22、时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压降降 温温 阶阶 段段ABCD升温 保温 降温小型罐升降温小型罐升降温快，可忽略；快，可忽略；但大型罐不可但大型罐不可忽视忽视min（二）（二） 灭菌时间的计算灭菌时间的计算V = V加热 + V维持 + V冷却 RT2 (E 2RT)V 加热加热 = t 加热加热 (T-T0)E2 RT2 (E 2RT)V 冷却冷却 = t 冷却冷却 (T-T0)E2R R ：气体常数；：气体常数；= 1. 986 = 1. 986 卡卡/ /克分子克分子

23、KKE E ：耐热孢子致死的活化能；：耐热孢子致死的活化能；= 65000 = 65000 卡卡/ /克分子克分子 T T：灭菌维持温度；：灭菌维持温度； 121 121 （393 K393 K）T T0 0：开始计算灭菌效果的温度；：开始计算灭菌效果的温度；100 100 （373 K373 K）例：1 1）小型发酵罐在）小型发酵罐在120120灭菌维持灭菌维持1515分钟，由分钟，由100 100 （100100以以下灭菌效果不计）加热至下灭菌效果不计）加热至120120的时间为的时间为5 5分钟，由分钟，由120120冷却冷却到到100100的时间为的时间为3 3分钟，计算总的灭菌时间。

24、分钟，计算总的灭菌时间。 1.9863932(65000 21.986 393)V加热加热 = 5 = 1.15 (393-373) 650002 1.9863932(65000 21.986 393)V冷却冷却 = 5 = 0. 69 (393-373) 650002V = V加热 + V维持 + V冷却 = 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min) 例 ）如果灭菌条件不变，大罐由如果灭菌条件不变，大罐由加热到加热到需分钟；冷却至需分钟；冷却至的时间为分钟；求大罐的时间为分钟；求大罐的维持时间的维持时间。 1.9863932(65000 1.986 393)V加热加热 V冷

25、却冷却 = （ ） (393-373) 650002.min则大罐维持时间V维持 = V（V加热V冷却）16.6 9.2 = 7.4 min在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间发酵罐规模（升） 维持时间（分） 200 17. 5 500 12. 6 5000 11. 3 50000 8. 8（三）分批灭菌的优缺点优点：不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单、灭菌效果可靠。不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单、灭菌效果可靠。对蒸汽的要求较低，一般对蒸汽的要求较低，一般3-4kg/cm3-4kg/cm2 2即可满足。即可满足。缺点：在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大在灭菌过程中蒸

26、汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大中小型罐经常采用四、培养基的连续灭菌四、培养基的连续灭菌 （连消） 将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌。 温度 （） 时间 （min) 121 24.8 130 4.1 138 0.72 146 0.14 154 0.029 163 0.0061灭菌时间与温度的关系（以杀死细菌芽孢为准）（一）连续灭菌流程1 配料罐 3 连消装置 4 维持罐 6 冷却装置 配料罐（兼作预热） 输料泵 连消塔（器）维持罐（管） 冷却器 发酵罐连续灭菌流程1 1、预热、预热可在专门的预热罐，也可用配料罐兼作温度：一般预热至一般预热至7070左右左右预热的物

27、料用泵泵入连消装置预热的物料用泵泵入连消装置输料泵： 常用常用 旋涡泵、往复泵、螺杆泵旋涡泵、往复泵、螺杆泵旋涡泵往复泵螺杆泵2 2、加热、加热常用连消装置有三类： 套管式连消器套管式连消器 汽液混合式连消器汽液混合式连消器 喷射式加热器喷射式加热器物料泵入加热器，培养基与蒸汽混合，温度迅速上升至130140套管式连消塔上疏下密，上疏下密，4545小孔，孔小孔，孔径径6 6毫米左右毫米左右培养液流动线速度小于培养液流动线速度小于0.1m/s ; 0.1m/s ; 在管内逗留时间在管内逗留时间为为15152020秒秒 汽液混合式连消器1 1 喷嘴喷嘴 2 2 吸入口吸入口 3 3 吸入室吸入室

28、4 4混合喷嘴混合喷嘴 5 5 混合段混合段 6 6扩大管扩大管喷射加热器3 3、保温、保温保温设备保温设备 （维持设备）（维持设备） 保温材料包裹保温材料包裹 两种形式： 罐式；管式罐式；管式 1、维持罐连续灭菌时，关连续灭菌时，关2 2开开1 1；预热罐中的物料输送完后，预热罐中的物料输送完后，关关1 1开开2 2。培养基的平均停留时间 = V / FM-平均停留时间平均停留时间 （s s）V- V- 维持罐的体积维持罐的体积 （ m m3 3）FM - FM - 培养基的流量培养基的流量 （m m3 3/s/s）Note: 培养基在维持罐的流动不可能非常均匀，可能产生沟流，培养基在维持罐的流动不可能非常均匀，可能产生沟流，造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值。为保证造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值。为保证灭菌彻底，在设计罐式维持器时，通常取平均停留时间的灭菌彻底，在设计罐式维持器时，通常取平均停留时间的3 35 5倍。倍。经验： 在灭菌温度为在灭菌温度为130130时，实际平均时间可取时，实际平均时间可取1010分钟；在分钟；在140140时则可取时则可取3 34 4分钟。分钟。2、管式维持器在设计管式维持设备时，须采用在设计管式维持设备时，须采用停留时间分布