项目4 无菌操作

1、？ 项目4 无菌操作植物组培流程植物组培流程 植物组培快繁步骤植物组培快繁步骤外植体选择外植体选择v一、一、 外植体的处理外植体的处理 v二、二、 外植体的消毒外植体的消毒 v三、三、 外植体的接种外植体的接种v四、四、 外植体培养条件外植体培养条件v五、五、 污染原因和预防措施污染原因和预防措施v六、六、 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施一、外植体的选择一、外植体的选择 外植体的选择与处理采前处理处理修整流水冲洗材料选取材料预处理材料灭菌材料二次修整灭菌剂浸泡酒精浸泡无菌水漂洗外植体的选择原则 （一） 具有植物固有的特征，具有代表性 （二） 材料幼嫩，生长健壮，无病虫害 （三

2、） 在生长初期选取 （四） 根据培养目的，选取适宜的外植体， 大小适宜 无论是离体培养繁殖种苗，或者无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质性状优良的种质，或特殊的，或特殊的基因型基因型。对材料的选择要有明确的目的，具对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。增加其实用价值。 外植体选择外植体选择的具体原则的具体原则1. 1. 生长健壮生长健壮在生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。原因：原因：代

3、谢旺盛再生能力强（比较容易培养成功）。2. 2. 不同部位不同部位 ：靠近植株的近基部比较易成功。 外植体选择外植体选择的具体原则的具体原则 植物的生长季节（生长最适季节）（生长最适季节） 植物的生长发育阶段。物质含量物质含量时间或季节时间或季节抑制物质抑制物质生长物质生长物质取材时间取材时间取材时间外植体选择外植体选择的具体原则的具体原则 材料太大材料太大: : 易污染，也不需要； 材料太小材料太小: : 多形成愈伤组织，甚至难于成活。 一般选取培养材料的大小，在0.5cm0.5cm1.0cm1.0cm。 如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。 茎尖分生组织：茎尖分生组织：12个叶原基，

4、0.20.3mm 叶片、花瓣：叶片、花瓣：5mm2 茎段：茎段：0.5cm 外植体选择外植体选择的具体原则的具体原则 沿植物主轴越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短，生理年龄越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官，反之相反。外植体选择外植体选择的具体原则的具体原则 从室外取回的接种材料往往带有较多的泥土、杂菌等，不宜直接接种，而且要达到外植体的规格要求，需要对材料进行必要的处理。（二）（二）接种材料的预处理接种材料的预处理（二）（二）接种材料的预处理接种材料的预处理 植物材料一般采取的预处理方植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的

5、部分，将准备使用的植掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。 二、外植体常规灭菌过程二、外植体常规灭菌过程把材料放进把材料放进70%70%的酒精中约的酒精中约30s30s。 用用0.1%0.1%的升汞（的升汞（HgCl2HgCl2）中浸泡）中浸泡10min10min。 或用或用10%10%的漂白粉上清液中浸的漂白粉上清液中浸10min10min 15min15min。 无菌蒸馏水冲洗无菌蒸馏水冲洗3 35 5次。次。 灭菌

6、时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。的接触。 在灭菌剂里滴入数滴在灭菌剂里滴入数滴0.1%0.1%的的Tween20Tween20（吐温）（吐温） 或或Tween80Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。湿润剂，则灭菌效果更好。 常用灭菌药剂的使用和效果常用灭菌药剂的使用和效果 灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间效 果次氯酸钠910易530很好次氯酸钙2易530很好漂 白 粉饱和浓度易530很好氯 化 汞0.11较难210最好酒 精7075易0.22好过氧化氢1012最易515好溴 水12易210很好硝 酸 银1较难530好抗 菌 素450

7、mg/L中3060较好v第一节第一节 外植体的选择外植体的选择 v第二节第二节 外植体的消毒外植体的消毒 v第三节第三节 外植体的接种外植体的接种v第四节第四节 外植体培养条件外植体培养条件v第五节第五节 污染原因和预防措施污染原因和预防措施v第六节第六节 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施第三节第三节 外植体的接种外植体的接种1 1操作人员操作人员w 操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。进入接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果, 进行操作前再用70%的酒精擦洗双手。 2操作期间操作期间 操作期间经常用70%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“

8、双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。 2操作期间操作期间 在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮 盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。4工具用后及时消毒工具用后及时消毒 工具用后及时消毒，避免交叉污染。 工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。 5空气中有灰尘空气中有灰尘 由于空气中有灰尘，因此在操

9、作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。 v第一节第一节 外植体的选择外植体的选择 v第二节第二节 外植体的消毒外植体的消毒 v第三节第三节 外植体的接种外植体的接种v第四节第四节 外植体培养条件外植体培养条件v第五节第五节 污染原因和预防措施污染原因和预防措施v第六节第六节 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施 通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。 分化器官需要光照，

10、并随着芽苗的生长需要加强光照。 普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx- 5000lx。第四节第四节 外植体的培养条件外植体的培养条件第四节第四节 外植体的培养条件外植体的培养条件 不同的植物有不同的最适生长温度。 大多数植物最适温度在2323 C-C-3232 C C之间。培养室一般所用的温度是2525 C C2 2 C C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。第四节第四节 外植体的培养条件外植体的培养条件 组织培养中的湿度影响主要有两个方面： 一是培养容器内的湿度：一是培养容器内的湿度：它的湿度条件常可保证100%。 二是培养室的湿度：二是培养室的湿度：它的湿度变

11、化随季节和天气而有很大变动。 湿度过低：湿度过低：会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化。 湿度过高：湿度过高：会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。第四节第四节 外植体的培养条件外植体的培养条件植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。v第一节第一节 外植体的选择外植体的选择 v第二节第二节 外植体的消毒外植体的消毒 v第三节第三节 外植体的接种外植体的接种v第四节第四节 外植体培养条件外植体培养条件v第五节第五节 污染原因和预防措施污染原因和预防措施v第六节第六节 外植体的褐变及其预防措施外植

12、体的褐变及其预防措施污染：污染：是指在组织培养过程中培养基和培养是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 一、污染的原因一、污染的原因污染的原因：污染的原因：从病源菌方面来分析主要有：从病源菌方面来分析主要有： 细菌：细菌：菌斑呈粘液状物，而且在接种后菌斑呈粘液状物，而且在接种后1-2天即可发现。天即可发现。 真菌：真菌：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3-10天才天才能发现能发现从污染的途径而言主要是：从污染的途径而言主要是：外植体带菌外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底、培养基及器皿灭菌不彻底、

13、操作人员未遵守操作规程等。操作人员未遵守操作规程等。二、污染的预防措施二、污染的预防措施常用灭菌方法常用灭菌方法v第一节第一节 外植体的选择外植体的选择 v第二节第二节 外植体的消毒外植体的消毒 v第三节第三节 外植体的接种外植体的接种v第四节第四节 外植体培养条件外植体培养条件v第五节第五节 污染原因和预防措施污染原因和预防措施v第六节第六节 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施第六节第六节 外植体的外植体的褐变及其预防措施褐变及其预防措施 褐变褐变是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。醌类又会在酪

14、氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不，最终衰老死亡。 褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，第六节第六节 外植体的褐变外植体的褐变及其预防措施及其预防措施褐变跟植物材料以下方面有关系： （1 1）基因型）基因型（2 2）材料年龄）材料年龄（3 3）取材部位）取材部位（4 4）取材时期）取材时期（5 5）外植体大小及受伤害程度）外植体大小及受伤害程度w外植体切口：太大易褐变，尽量小第六节第六节 外植

15、体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施光照与温度光照与温度温度过高温度过高光照过强光照过强均可使多酚氧化酶的活性提高，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。从而加速外植体的褐变。第六节第六节 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施w（1 1）培养基状态）培养基状态w（2 2）无机盐）无机盐w（3 3）植物生长调节物质）植物生长调节物质w（4 4）抗氧化剂）抗氧化剂w（5 5）吸附剂）吸附剂w（6 6）pHpH值值第六节第六节 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施第六节第六节 外植体的褐变及其预防措施外植体的褐变及其预防措施w1 1选择适宜的外植体：选择适

16、宜的外植体： 外植体应选择分生能力较强的材料。外植体应选择分生能力较强的材料。 如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等材料培养褐变程度比较轻。 w2 2 采用适宜的培养基和光温条件：采用适宜的培养基和光温条件：w3 3 在培养基中加活性炭、抗氧化剂和在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂其他抑制剂w4 4 缩短转瓶周期缩短转瓶周期 这是组培中控制褐变常用且有效的方法。小小 结结第一节第一节 外植体的选择外植体的选择 ：优良种质、健壮植株优良种质、健壮植株 、最适的时期、最适的时期、适宜的大小。适宜的大小。 第二节第二节 外植体的消毒：外植体的消毒：9种常用灭菌药剂的使用及其效果种常用灭菌药剂的使用及其效果 、外、外植体的灭菌方法。植体的灭菌方法。 第三节第三节 污染原因和预防措施：污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植