SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术试验报告

1、M户a票实验报告一、实验目的和要求1, 了解SSR标记的检测方法；2, 了解PAGE银染检测SSR的原理;3,掌握PAGE银染检测SSR的技术。二、实验内容和原理1 .根据DNA大小及类型的不同，可通过电泳进行分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp,适宜于微卫星等位基因间的差别检测。2 .银染方法的建立始于1979年对蛋白质的染色，以后逐渐应用于核酸。3,银染原理：扩增DNA经电泳分离后，Ag+可与之形成稳定的复合物，在甲醛的作用下被还原成银颗粒，呈现棕褐色谱带。三、实验仪器与材料1、实验材料：已准备的12个水稻材料的PCR产物。2、实验耗材：PCR管、枪头（t

2、ip）、1次性塑料手套等；仪器设备：PCR仪、电泳仪、垂直电泳槽及制胶装置、凝胶成像系统/扫描仪、移液枪、塑料托盘等。3、 试剂及配制： 引物（10mM）:根据含有SSR的序列设计而合成的，用无菌双蒸水配制所需浓度。 dNTP溶液（2mM）:将采购的溶液分装，直接稀释到所需浓度即可。 TaqDNA聚合酶（5U/科）：直接采购。 10xPCR缓冲液：直接采购。 DNA分子量标准：直接采购。 0.5mol/LEDTA:在800ml水中加入186.1gEDTA-Na.2H2O,搅拌并用氢氧化钠调PH至8.0,定溶至1L,分装后高压灭菌备用。 TBE电泳缓冲液（Tris-硼酸5冲士存液）：Tris碱5

3、4g/L和硼酸27.5g/L溶于蒸储水，加入20ml（pH8.0）0.5mmol/LEDTA,定溶到1L。用时稀释5倍。 上样液（6X）:澳酚兰0.25%、二甲苯青0.25%、蔗糖40%的混合液。 封胶液：1g琼脂糖放于100mlTBE煮沸溶解、混匀。 30%丙烯酰胺（100ml）:将丙烯酰胺29克和N、N-亚甲叉双丙烯酰胺1克用蒸储水溶解，定容至100ml。或从公司直接采购的40%（Acr:Bis=29:1）溶液。4、实验材料说明： SSR标记：共6个，每组1个 模板12个：C101、谷梅2号、谷梅4号、IR24、IR64、富锦、CK122、株6S、R2106、316S、R248、日本晴 P

4、CR:反应总体积为15科l,包括7.5科的2HaqMasterMix（含dNTP）,1科1的模板DNA（50-100ng）,10M的上下游引物各0.5ul,用去离子水补足至15（il;94C5min；94c1min,55c1min,72c1min,共35个循环；72c延伸8min,4c下保存。 样品：每组领取12个PCR样品，记录组号和点样位置。四、操作方法和实验步骤1、组装玻板与封胶：将玻璃板与胶皮套组放在一起，并用封胶液（1%琼脂糖）将底步空隙封闭，制成铸胶槽。2、制胶：配制40ml的8%胶液。先加水，最后加TEMED和10%过硫酸镂，混匀后立即注入铸胶槽中，并插入梳子，静止聚合40分钟以

5、上。在灌胶时注意不要产生气泡。3、上样：凝胶完全聚合后拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗梳2-3次，然后在上下槽中加满电泳缓冲液后即可点样电泳。在含扩增产物的反应管中按1:5加入上样缓冲液混匀（已做），取0.8轻轻加到梳孔中。4、电泳：点样完毕后，恒压120V（可根据时间适当调整）电泳至澳芬兰至胶板底部（2h）。5、剥胶与固定：小心剥下凝胶，去离子水漂洗，然后加入固定液，轻摇固定10-15分钟。（固定步骤可省略）6、染色：倒去固定液，去离子水中漂洗，加入染色液，轻摇染色10分钟。7、显色：去离子水洗2次，加入显色液，轻摇显色；观察条带的出现情况，当条带显示清晰后，立即加入10%乙酸终止，然后加水冲洗。

6、8、记录结果：拍照或记录结果，实验报告中写明SSR标记（组号）、材料名称，计数扩增带数（表格），计算材料间的遗传相似系数和所用标记的多态信息含量等，并对结果及相关问题进行讨论。五、实验数据记录和处理1、电泳结果记录：使用3号RM3867的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测结果如下图1:C101、谷梅2号、谷梅4号、IR24、IR64、富锦、CK122、株6S、R2106、316S、R248、日本晴图1RM3867o根据上图1,除去无法识别的12号材料电泳结果，与已有的结果图对比，可确定我们组使用的是表1RMX在12个材料中的扩增情况记录RM3867在12个材料中的扩增情况，如下表1:材料C101

7、谷梅2号谷梅4号IR24IR64富锦CK122株6SR2106316SR248日本晴条带数333333433332、计算材料间的遗传相似系数和所用标记的多态信息含量根据图1及遗传相似系数(GS)公式GS=2Nij/(Ni+Nj)计算，12个材料之间遗传相似系数结果如下表2(Nij表212个材料之间的遗传相似系数为材料i和j共有的扩增片段数目，Ni为材料i中扩增片段数目，Nj为材料j中扩增片段数目)：GSC101谷梅2号谷梅4号IR24IR64富锦CK122株6SR2106316SR248日本晴C10110.3311110.570.330.670.670.670.67谷梅2号0.3310.330

8、.330.330.330.8610.670.670.670.67谷梅4号10.3311110.570.330.670.670.670.67IR2410.3311110.570.330.670.670.670.67IR6410.3311110.570.330.670.670.670.67富锦10.3311110.570.330.670.670.670.67CK1220.570.860.570.570.570.5710.860.860.860.860.86株6S0.3310.330.330.330.330.8610.670.670.670.67R21060.670.670.670.670.670.

9、670.860.671111316S0.670.670.670.670.670.670.860.671111R2480.670.670.670.670.670.670.860.671111日本晴0.670.670.670.670.670.670.860.671111RM3867的多态信息含量：PIC=1-Zpij2=1-(52/122+42/122+12/122+22/122)=0.681六、实验结果与分析由以上各图表：1)根据图1条带，12个样品的条带数均为3条，且出现了三种带型，1、3、4、5、6号样品的条带为同一种带型，2、7、9、10、11号样品的条带为另一种带型，8号样品条带为第三种

10、带型，由此可以判断RM3867可检测到3个等位基因，3种基因型，表现出一定的多态性。2) 9号样品的条带发生了明显的倾斜，推测可能是由于凝胶浓度不均一，或是胶体倾斜。3) 12号样品的条带无法辨识，可能是制胶的问题，加样孔靠近胶的边缘，样品加到加样孔中后不能沉到底部，一直处于悬浮状态，加了三次也未加样成功。4)根据表2,前11种样品材料间遗传相似系数变化范围0.331,平均数为0.759,整体较高，说明前11个样品之间存在一定的亲缘关系。5)根据图1和表2遗传相似系数结果，C101谷梅4号、IR24、IR64、富锦亲缘关系较近，谷梅2号、CK122、R2106、316S、R248亲缘关系较近，

11、株6s和这10种亲缘关系均较远。6)PIC值指的是一个标记用于在群体检测多态性的价值，等位基因频率越平等，PIC值就越大，从我们计算的结果来看，RM3867标记的多态信息含量为0.579,说明RM3867标记在一定程度上可衡量样品群体的多态性，。7)实验得到的凝胶背景色较浓、分辨率不高，在统计时可能会造成误判，导致分析结果不完全准确。七、讨论、心得1、实验显色后发现凝胶背景的颜色过深导致条带结果不是很清晰，可能造成的原因有：+1)实验中用于配制电泳缓冲液的水不是真正的超纯水或者放置时间过长有污染，带有一定离子会与Ag发生反应，造成背景颜色变深。2） 银染反应的碱性不够。有研究发现，银染反应的进

12、行需要一个碱性(加入NaOH、KOH等)的环境，随着实验环境碱性的增强，胶的背景可变浅，并有助于祛除胶中非特异的银颗粒，而当NaOH浓度低于2%时，胶的背景变深，不利于DNA带的显现。而在显色液中加入少量其他的非中性弱酸盐如NaHCO3、CHOONa、CHOOK、EDTA-Na等等，有助于条带的显现，并保持显带的稳定性，维持胶的浅色背景,使其在显色液中较长时间放置背景也不会加深。3）实验操作过程中加入终止剂后显色没有马上终止，造成背景颜色继续加深，可能是加入终止剂后混合不够均匀或者终止反应需要一定时间。应在出现显色条带后立即加入终止剂并充分混匀而不是条带充分清晰后加入终止剂，防止背景颜色过深不

13、利于观察分析。2、多数PCR扩增片段采用的琼脂糖凝胶电泳、EB染色只可检测出少于10ng的DNA,且琼脂糖电泳的分辨率较低。而聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨力极高，用于测序的聚丙烯酰胺凝胶可分离相差1bp的DNA片段，能够将品种特异性的谱带分离出来，进而判定纯度和真实性，特别适合于像SSR这样的小片段扩增产物的检测。这是因为两种介质的分子结构、交联状况及其浓度大小变化形成的分子筛孔径不同，两者的分离范围和分离精度存在较大差异。会对聚丙烯酰胺凝胶结果产生影响的因素较多，不同的试验处理对成像结果都有影响，甚至会影响试验结果分析，因此需要通过预实验对聚丙烯酰胺凝胶电泳参数进行优化，如聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电

14、泳时间及染色过程的各种细节都是其中重要的参数。操作者在试验工作过程中一定要认真缜密，才能得到PCR标记产物多态性条带清晰、明亮、稳定的试验结果。3、本实验使用的银染法，具有染色结果明显的特点，适合于非标机引物检测。银离子可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂（如甲醛）在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。但是多数常规和改良的显色方法背景色浓、分辨率不高。这大多是由于AgNO3NaOH和甲醛浓度较高，银染和显影时间不易控制所致，实验应在试剂浓度、银染和显影时间上做优化。另外，过程中可能涉及有毒物质的使用，需要注意操作。4、实验注意事项：1）实验中使用的水一定要是超纯水或去离子水，否则会影响背景，严重时可能导致实验结果无法分析。2）显影使用白色器皿装胶，清洗干净，比较方便较清晰地辨别出淡淡的条带。3） 实验证明硝酸银溶液浓度不宜超过0.15%,浓度较高的NaOH（浓度超过1.5%）很容易显影过度。采用“低浓度NaOHX长时间显影”的策略，而不采用“高浓度NaOHX短时间显影”的策略。4）浸没于NaOH+甲醛溶液中显影，看到模糊的条带后立即大量双蒸水冲