DGGE试验操作步骤—详细

1、DCODESYSTEM安装培训ISOP一、培训前需跟用户确认以下事项1,试剂准备(1)变性浓度0%勺储存液(2)变性浓度100%勺储存液(3) 50X或10X的TAE缓冲液(后续需要稀释为7L左右的1X缓冲液使用，需要准备约7L超纯水)(4) 10%过硫酸钱(AP)：0.1g过硫酸钱溶于1ml的去离子水中(5) TEMED(直接跟试剂公司购买)(6)上样缓冲液(如实验室有现成的6X或10Xloadingbuffer,则不需配该项了)(7)核酸染色剂(ERGOLDVIEW,SYBRGREEN(酸染色试剂均可以)(8)可以进行染色和脱色的容器，磁盘或饭盒等，长宽20cm以上(9)移液器、枪头实验前

2、请先确定配置多大浓度的胶以及变性浓度的范围(如20%-70%或者30%-60%,最好可以在相关文献中查到)。不同浓度的胶适用于不同片段大小的分离。变性浓度的范围直接关系到片段的分辨力。Tlietablebelowprovidesthepercentageacrylamidebtsneededfaraparticularsizerange.|GelPeiTentagePairSepaiation6%300-1000bp8%200-400bp10%100-300bp变性浓度为0%和100%的溶液可配置，作为储存液，用来实验时配置成不同变性浓度的胶。详细的配置方法以及所需试剂请参考以下图片。Amou

3、nt38.93g107gto100.0ml40%Acrylamide/Bis(37.5:1)ReagentAcrylanudeBi$-acr>4amidedHQFilterthrougha0.45jifilterandstoreat4.|50xTAEBufferReagentAmountFinalConcentrationTnsbaseAceticacid,glacial0.5MEDTA.pHSOdHQ242.0g2M57.1mlIM100.0nil50mMto1.000.0mlMix.Autoclavefor20-30minutes.Storeatroomtemperature.0%D

4、enaturingSolution6%Gel8%Gel10%Gel12%Gl40%AcrylamideBis15ml20ml25nil30ml50xTAEbuffer2ml2ml2ml2mldHQ83ml78ml73ml68mlTotalvolume100ml100ml100nil100mlDegasfor10-15minutes.Filterthrougha0.45pfilter.Storeat4inabrownbottleforapproximately1month.100%DenaturingSolution6%Gel8%Gel10%Gel12%Gl40%AciylaiiudeBis15

5、ml20ml25ml30ml5OxTAEbuffer2nil2nil2ml2mlFormamide(deionized)40nil40ml40ml40nilUrea42g42g42g42gdH2Oto100mlto100mlto100mlto100mlDegasfor10-15nunutes.Filtertlirougha0.45pfilter.Storeat4mabrownbottleforapproximately1month.A100odenaturantsolutionrequiresre-dissolvingafterstorage.Placetliebottleinawamibat

6、handstirforfasterresults.kGelLoaciinaDyeReageutAmountFinalConcutratiouBromopheiiolblue0.25ml0.05%2%X>lenecyanol0.25ml005%TOO%Glycerol7.0ml70%dHQ2,5mlTotalvoluinc10.0mlStorentroomtemperatine1工TAERunningBufferReagentAmount50xTAEbuffer140mldHQ6.860mlTotalvolume7,000ml2,所需其它仪器设备(1)电源(伯乐公司的basic和HV均可)

7、可以设置电压至200V左右。(2)核酸成像设备可以进行核酸的紫外成像仪，成像面积最小16cmX16cm3,如果需要跑用户自己的样品，请提前准备好尽量新鲜的PCR产物，最好先经过琼脂糖电泳验证条带是否单一，以及亮度如何(上样量为180-300ng/well),储存于-20°Co、现场培训检查仪器外包装、清点仪器及配件，跟用户现场确认。1,梯度胶的组装和灌制475梯度仪和注射器等小组件的组装请参考下图不同尺寸大小的玻璃板及不同垫片厚度的组合,所需要胶的总体积、每个注射器所需的体积）都是不同的，具体和475生成仪上的体积调整设置（上图中volumesettingindicator参考下图S

8、p冰钮SizeG«LSizeVolumeVolumepoiAdjustmentSMingeSitingmlnllnjmlnllnlllnl向ml0.75mm1.00min1.50mm0.75nim7.5x10cm16x10cm16x16cinLOOnun75x10an16x10an16x16an1.50nun7.5x10cm16x10cni16116cniSp%w专rThickness25ml15im30ml20ml45nil26ml(1)组装制胶架DGGE实验推荐使用16X16cm的玻璃板组件。戴手套和口罩进行操作。在一个干净的平稳的场所，提前将玻璃板、垫片、海绵垫片等小组件彻底清

9、洗干净晾干(新的可直接用)。使用非凹槽的垫片，将其放置于长短玻璃板两侧之间，注意垫片上侧的小孔的位置，不可随意更换。按照以下图片，将两个夹子将带有垫片的两个玻璃板左右夹紧，下端平整，然后用纸卡片插入两个玻璃板中间，调整垫片的位置和两个夹子的松紧，确保组装的密闭性，玻璃板上端平整，垫片的位置整齐，否则在实验中漏胶或buffer(2)灌制梯度胶a,将海绵垫固定在制胶架上，把类似三明治结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意将短玻璃的一面正对着自己。b,共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm,短的那根长9cmo将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小

10、套管相连，并连在30ml的注射器上。注意管内不要有残留的胶液或者水等杂物。c,在两个注射器上分别标记高浓度与低浓度，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置！例如16*16cmgels(1mmthick):设体积调整装置到14.5。d.反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cmgels(1mmthick)：设体积调整装置到14.5。e,配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。如选择的浓度范围是20%-70%则需要通过计算，分别加入不同量的0嘀口100%W存液

11、来分别配置。以配置15ml的20%勺胶为例，X为加入0%勺体积，Y为加入100%勺体积X+Y=15X0%+Y100%=15x20%即可计算出期口Y各加多少以下的步骤是有时间限制的(7-10min)请确定上述5个步骤准备好了再进行以下操作，且需要对以下步骤操作熟练。f.在两个离心管中加入APS和TEMED,使其终体积浓度为0.09%（V/V）,迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有高浓度的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。g.通过分别推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动胶溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最

12、后凝胶体积不够。操作过程难免有浪费和误差，所以配置的胶的体积应该比设置体积多一些，如设置的14.5,则可配置胶的体积可以为15mlh.分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确！（475梯度仪上标注好了topfilling哪面放置高浓度注射器哪面放置低浓度注射器）i.将两个注射器的聚丙烯管同Y形管相连，Y型管的另一头连接第三个聚丙烯管（9cm）j.把针连接到聚丙烯管上，放置于玻璃板的中间位置，为了方便，可以用小夹子使其固定。k.轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板

13、中。1 .小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。m.尽快清洗注射器和聚丙烯管等，避免残留的胶凝聚后不容易清洗。注意，待胶凝聚的时候正好可以提前打开电泳控制设备，将缓冲液预热至60。C,这样可以更节省时间2 .“三明治芯”的组装(1)确保浅黄色的“三明治芯”上面的U型白色垫片封闭性好，且干净，无凝胶等附着在垫片上面(2)将已经凝聚好的胶夹子整体从制胶底座上拿下来，并小心的取下梳子(3)将玻璃板固定到三明治芯上，短板在三明治芯的里面，长板在外面。如同时跑两块胶，则另一面也同样安装好玻璃板，这样在三明治芯的上端就形成了一个上部的电泳上槽。如果只跑一块胶，则另一面的玻璃板中间不用放垫片即可。同样安装到

14、三明治芯上。(4)将约350ml的runningbuffer倒入上槽内，目的是确认漏不漏液，如果有漏液的情况，则需将buffer先倒出，重新组装玻璃板，直至不漏液为止。(tips可以在U型垫片上滴几滴buffer以便增加润滑性和密闭性)3 .加缓冲液、上样、运行(1)在电泳槽中加入7Lrunningbuffer(2)待温度升至设定温度时，关闭系统，将温度控制模块搬下，先放置于黑色的铁架子上，将上述安装好的“三明治芯”放入电泳槽内，注意“三明治芯”上的红色按钮在右边，黑色按钮在左边。最后再将温度控制模块放上去。(3)打开power、pump、heater按键。拿掉clearloadinglid(

15、放在温度控制模块上面的透明的带有电极的长方形组件)，用移液器吸取buffer吹洗一下加样孔附近未完全凝聚的碎胶等杂物。将loadinglid放回，按紧。a60.0hEftTERd5ET|6Q.Q/公(4)缓冲液的温度回升至设定温度，需要大概10-15min(5)将loadinglid拿掉，同上吹洗点样孔，小心点样(最好用测序胶用的枪头，前端很长很细),将loadinglid放回，按紧。(6)在电源上设置好电压，开始运行程序。对于DGGECDGE推荐电压130V,不能超过180V。电压过高电泳过程热量影响电泳结果。对于TTGE推荐130V,不能超过150V。电压过高电泳过程热量影响温度梯度4 .电泳结束