乙酰半胱氨酸分析

1、 乙 酰 半 胱 氨 酸 颗 粒46检查项目方法（列明方法编号）放行标准限度货架期标准限度性状为可溶性细颗粒；气芳香，味酸甜（SOP/YC005-01-01性状）为可溶性细颗粒；气芳香，味酸甜为可溶性细颗粒；气芳香，味酸甜鉴别HPLC法（SOP/YC005-01-01鉴别）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致酸度中国药典2010年版二部附录H（SOP/YC005-01-01酸度）2.03.02.03.0干燥失重中国药典2010年版二部附录L（SOP/YC005

2、-01-01干燥失重）不得过2.0%不得过2.0%溶化性中国药典2010年版二部附录N颗粒剂-溶化性（SOP/YC005-01-01溶化性）全部溶化或轻微浑浊，不得有异物全部溶化或轻微浑浊，不得有异物装量差异中国药典2010年版二部附录N颗粒剂-装量差异（SOP/YC005-01-01装量差异）符合规定符合规定有关物质HPLC法（SOP/YC005-01-01有关物质）L-胱氨酸（杂质A）、L-半胱氨酸（杂质B）、N,S-二乙酰-L-半胱氨酸（杂质D）的量均不超过0.5%，N,N-二乙酰-L-胱氨酸（杂质C）的量不超过0.5%，杂质总量不得过1.0%L-胱氨酸（杂质A）、L-半胱氨酸（杂质B）

3、、N,S-二乙酰-L-半胱氨酸（杂质D）的量均不超过0.5%，N,N-二乙酰-L-胱氨酸（杂质C）的量不超过1.0%，杂质总量不得过1.5%微生物限度中国药典2010年版二部附录 J微生物限度检查法（SOP/YC005-01-01 微生物限度检查）细菌数1000个/g，霉菌和酵母菌数100个/g，大肠埃希菌不得检出细菌数1000个/g，霉菌和酵母菌数100个/g，大肠埃希菌不得检出含量HPLC法（SOP/YC005-01-01含量测定）95.0%105.0%90.0%110.0%1性状本品应为可溶性细颗粒；气芳香，味酸甜。1.2鉴别(1)取本品适量（约相当于乙酰半胱氨酸0.2g），加水20ml

4、溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.5，并用水稀释至40ml,作为供试品溶液；另取乙酰半胱氨酸对照品0.2g，同法制备作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录B）试验，吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4:1:5）混合并平衡10分钟的上层液为展开剂，展开后，取出，在热气流下吹干，再于碘蒸气中显色，供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点相同。（2）HPLC法：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。以上（1）、（2）两项可选做一项。1.3 检查酸度检查方法：取本品，加水制成1

5、0%的溶液，依法测定（2010年版二部附录H），pH值应为2.03.0。干燥失重检查方法：取本品，在70干燥4小时，减失重量不得过2.0%（2010年版二部附录L）。溶化性检查方法：取供试品10g,加热水200ml，搅拌5分钟，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑浊，但不得有异物。装量差异检查方法：应符合规定（2010年版二部附录N颗粒剂-装量差异）。有关物质检查方法：HPLC法色谱条件：色谱柱：C18 流动相：硫酸铵缓冲液（取硫酸铵5.00g、庚烷磺酸钠4.04g，用水稀释至1000ml，用7mol/L的盐酸溶液调节pH值至2.0）：甲醇（93：7） 柱温：30 检测波长：205nm流速：1.0ml/

6、min 进样体积：10µl理论塔板数：按乙酰半胱氨酸峰计算不低于1000。测定法：取含量测定项下的细粉适量（约相当于乙酰半胱氨酸25mg），精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液；另取胱氨酸（杂A）对照品和半胱氨酸（杂B）对照品适量，精密称定，（杂A需加1M盐酸使溶解），加流动相分别溶解稀释制成每1ml中约含有2.5g的溶液，摇匀，作为杂质A，杂质B对照溶液；取自身对照溶液20l注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的20%；精密量取

7、杂A与杂B对照溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；再精密量取供试品溶液20l，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的5倍。供试品溶液色谱图中，如有与杂A和杂B保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得过0.5%；杂C的峰面积 (杂C相对保留时间约为1.6) 除以校正因子（校正因子=1.21）之后不得大于自身对照溶液的主峰面积1.0倍（1.0%），杂D的峰面积 (杂D相对保留时间约为1.8-2.0) 除以校正因子（校正因子=0.78）之后不得大于自身对照溶液的主峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于自身对照溶液主峰面积的1.5倍（1.5%）。计算公式： A

8、X×CR×Vx×W×R 杂A/杂B(%) ×100% AR×MX×K 式中：AX为供试品溶液相应杂质的峰面积；AR为杂质对照溶液的主峰面积；MX为供试品的称取量，mg；CR为杂质对照品的浓度，mg；R为杂质对照品自身的含量；W为平均袋重，mg；K为每袋的标示含量，mg。 AX 杂质C(%)= ×1% 1.21×AR 式中：AX为 杂质C的峰面积； AR为自身对照溶液的主峰面积； AX 杂质D(%)= ×1% 0.78×AR 式中：AX为 杂质D的峰面积； AR为自身对照溶液的主峰面积；

9、 AX 其他单个杂质(%)×1% AR 式中：AX为供试品溶液其他单个杂质的峰面积； AR为自身对照溶液的主峰面积；杂质总和(%)=杂A(%)+ 杂B(%)+杂C(%)+ 杂D(%)+其他单个杂质的和(%)微生物限度 含量测定 检查方法：HPLC法色谱条件：色谱柱：C18 流动相： 0.05mol/L磷酸氢二钾溶液（用稀磷酸调节pH值3.0） 柱温：30 检测波长：214nm流速：1.0ml/min 进样体积：20µl理论塔板数：按乙酰半胱氨酸峰计算不低于1000。测定法 ：取本品10袋，将内容物全量转移至500ml量瓶中，加焦亚硫酸钠溶液（12000）适量，振摇使溶解并稀

10、释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置100ml量瓶中，用焦亚硫酸钠溶液（12000）稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。另取乙酰半胱氨酸对照品约50mg,精密称定，置100ml量瓶中，加焦亚硫酸钠溶液（12000）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。 计算公式： AX×MR×R×VX 含量（%） = ×100% AR×VR×K式中：AX为供试品溶液的峰面积；AR为对照品溶液的峰面积；MR为对照品的称取量，g；VR为对照品稀释体积，ml；VX

11、为供试品稀释体积，ml；R为乙酰半胱氨酸对照品的含量；K为乙酰半胱氨酸颗粒的规格，g。分析方法的验证按照化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则、化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则、化学药物杂质研究技术指导原则、化学药物残留溶剂研究技术指导原则以及2010年版中华人民共和国药典附录中有关的指导原则提供方法学验证资料，进行方法学验证，结果如下：含量测定方法学验证结果项目验证结果专属性空白辅料基本无干扰线性和范围在108.44µg/ml1084.40µg/ml范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，R=0.9998定量限、检测限主成分的定量限为0.856ng,峰面积的R

12、SD%=2.75，保留时间的RSD%=0.76准确度在80%120%浓度范围内，回收率为：99.21%-104.75%，平均回收率为101.74%，RSD为1.77%精密度重复性：平均值为99.95%，RSD为0.61%中间精密度：平均值为99.93%，RSD为0.06%溶液稳定性测试液在5小时内稳定耐用性参数的微小调整对结果均无显著影响方法的确定 参考乙酰半胱氨酸颗粒（中国药典2010版第二部）的含量测定方法,照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）对本品的含量测定条件进行了试验。色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸氢二钾溶液（用稀

13、磷酸调节pH值3.0）为流动相；检测波长为214nm。理论板数按乙酰半胱氨酸峰计算不低于1000。测定法：取本品10袋，将内容物全量转移至500ml量瓶中，加焦亚硫酸钠溶液（12000）适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置100ml（0.1g规格）或200ml（0.2g规格）量瓶中，用焦亚硫酸钠溶液（12000）稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取20ml注入液相色谱仪，记录色谱图。另取乙酰半胱氨酸对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加焦亚硫酸钠溶液（12000）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。仪

14、器、试剂及色谱条件仪器：岛津SPD-10AVP紫外可变波长检测器岛津LC-10ATVP高压恒流泵HW2000 色谱工作站试剂：磷酸氢二钾 分析纯 南京化学试剂有限公司 水 纯化水 自制 磷酸 分析纯 南京化学试剂有限公司 焦亚硫酸钠 分析纯 国药集团色谱条件：色谱柱： C18柱，5m，4.6mm×250mm；流动相：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液（用稀磷酸调节pH值3.0）；检测波长：214nm； 流速：1.0ml/min；检测波长的确定取乙酰半胱氨酸对照品适量，精密称定，用焦亚硫酸钠溶液（12000）稀释制成每1ml含乙酰半胱氨酸10g的溶液；照紫外-可见分光光度法（中国药典20

15、10版二部附录A），于190nm400nm扫描，结果发现乙酰半胱氨酸对照品为末端吸收。参照乙酰半胱氨酸颗粒质量标准（中国药典2010年版二部），选用214nm为含量的测定波长。见附件5，第1页。空白辅料干扰称取处方量空白辅料约0.225g，置50ml量瓶中，用焦亚硫酸钠溶液（12000）溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。取空白辅料溶液20l注入液相色谱仪，记录谱图。见附件5，第2、3页。结果显示：空白辅料不干扰本品含量的测定。含量测定线性试验精密称取乙酰半胱氨酸对照品27.11mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加焦亚硫酸钠溶液（12000）溶解并稀释至刻度、摇匀，作为贮

16、备液。分别精密量取贮备液适量置合适量瓶中，用焦亚硫酸钠溶液（12000）稀释制成一系列浓度的供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液及贮备液各20l注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度（mg/ml）为横坐标（X），绘制标准曲线。图谱见本资料附图第15-20页，结果见表1。表1 乙酰半胱氨酸颗粒含量测定线性试验浓度（µg/ml）峰面积回归方程12平均108.44 599590593048596319y = 4888.1x +99053R = 0.9998271.10144690214478081447355433.76219175621866042189180542

17、.20282005428070442813549813.304071612406285240672321084.40539138853739705382679结果表明：乙酰半胱氨酸在浓度108.44µg/ml1084.40µg/ml范围内峰面积A与浓度C呈良好的线性关系。定量限取乙酰半胱氨酸对照品适量，用焦亚硫酸钠溶液（12000）配成一定浓度的溶液。按倍倍稀释的办法，信噪比S/N=10，取20l 注入色谱仪，记录色谱图，得到定量限为0.856ng（检测浓度为0.0428g /ml）。附件6，第73-77页。 回收率试验精密称取乙酰半胱氨酸原料适量作为主药，取50袋处方量辅

18、料，分别加入50袋处方量的80%、100%、120%的主药，混合均匀，配制模拟样品，精密称取此样品适量各3份，按含量测定方法测定，计算回收率。图谱见本资料附图第22-34页，结果见表2。表2 乙酰半胱氨酸颗粒含测回收率试验结果(n=9)编 号加入量（mg）测得总量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）80%120.9821.14100.78101.741.77221.3422.08103.47321.3822.13103.55100%125.7225.79100.29226.0126.23100.83325.8927.12104.75120%130.6430.4099.21230.7

19、931.25101.52331.2631.66101.29结果：本法回收率好，辅料对含量测定不干扰。精密度试验 重复性试验取本品（批号：110606），照含量测定项下方法制备样品，平行6份，测定含量。结果见表35，图谱见本资料附图第35-45页。表3 乙酰半胱氨酸颗粒含量测定重复性试验结果（n=6）次 数123456含 量（%）99.9099.1699.8599.69100.06101.02平均含量（%）99.95RSD（%）0.61中间精密度试验取本品（批号：110606），分别照含量测定项下乙酰半胱氨颗粒的含量测定方法， 由不同分析人员在不同日期内依法测定，测定结果见表4，图谱见本资料附图

20、第50-65页表4 乙酰半胱氨酸颗粒含量测定中间精密度试验(n=3)天数(天)123人 员AAB色谱柱含量（%）99.9599.8699.97平均值（%）99.93RSD （%）0.06结果表明：用本法测定乙酰半胱氨酸颗粒含量中间精密度良好，方法可行。 溶液稳定性试验照含量测定项下方法配制样品溶液，考察其溶液稳定性，分别于0、1、2、3、4、5、6小时依法测定，样品的含量测定结果见表5，图谱见本资料附图第35-40、46-49页。表5 乙酰半胱氨酸颗粒含量测定溶液稳定性试验时间（h）0123456含量（%）99.90100.0199.9298.6699.7099.9894.23平均（%）98.

21、91结果表明：含量测定溶液在5小时内稳定。耐用性试验按照中国药典2010年版附录的要求对本方法含量进行耐用性试验考察，主要考察了不同柱温、不同流速、不同流动相比例、不同pH值、不同品牌或不同批号的同类型色谱柱等的变化对测定结果的影响情况。主要考察含量测定供试品溶液中，主峰的理论塔板数、拖尾因子、保留时间、主药的含量，实验结果见表6至表14，图谱见本资料附图第66-103页。表6 耐用性试验条件列表耐用性研究项目试验方法的条件确认的耐用性范围色谱柱温度302535波长214209219流速1.0ml/min0.8ml/min1.2ml/min色谱柱C18柱（5m，4.6mm×250mm）不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱3根pHpH3.0±0.2表7 耐用性试验结果-不同柱温条件主峰的理论板数主峰的拖尾因子样品测定含量（%）25-1115661.2410521108.4130-1120491.24 110.2030-2120471.20108.7635-1126021.19105.7335-2118651.19105.06表8 耐用性试验结果-不同波长条件主峰的理论板数主峰的拖尾因子样品测定含量（%）209nm-1108451.24101.82209nm-2109421.2