第三章 核酸化学

1、Company L第第三三章章核核酸酸化化学学冷冷春春玲玲Company Lv 本章主要介绍核酸种类、化学组成、结构和理化性质。本章主要介绍核酸种类、化学组成、结构和理化性质。v 1、了解核酸的概念、发展简史及重要性。、了解核酸的概念、发展简史及重要性。v 2、了解核酸的分类及分布。、了解核酸的分类及分布。v 3、掌握核酸的组成成分、掌握核酸的组成成分(碱基、戊糖、核苷、核苷酸碱基、戊糖、核苷、核苷酸)的化学组成特的化学组成特点。点。v 4、掌握、掌握DNA的一级结构及一级结构的意义。的一级结构及一级结构的意义。v 5、掌握、掌握DNA的二级结构：双螺旋结构模型要点；了解的二级结构：双螺旋结构

2、模型要点；了解DNA双螺旋双螺旋的不同构象类型：的不同构象类型：A-DNA、B-DNA、Z-DNA等；了解等；了解DNA的三的三级结构。级结构。v 6、了解、了解RNA的种类，掌握与蛋白质合成有关的三种的种类，掌握与蛋白质合成有关的三种RNA的功能。的功能。v 7、掌握、掌握tRNA的结构：三叶草叶型的结构特点。的结构：三叶草叶型的结构特点。v 8、掌握核酸的性质、掌握核酸的性质,一般理化性质、紫外吸收性质、核酸的变性与复一般理化性质、紫外吸收性质、核酸的变性与复性、分子杂交。性、分子杂交。v 9、了解核酸的序列测定。、了解核酸的序列测定。Company Lv【授课内容授课内容】 1概述：核酸

3、的发现和研究进展概况概述：核酸的发现和研究进展概况 核酸的分类、分布和生物学意义核酸的分类、分布和生物学意义 2核酸的化学组成核酸的化学组成 3DNA的分子结构的分子结构 4RNA的结构与功能的结构与功能 5核酸的理化性质核酸的理化性质 6核酸酶的分类原则及作用特点核酸酶的分类原则及作用特点 7核酸的核苷酸序列测定基本原理核酸的核苷酸序列测定基本原理Company Ll 核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不可缺少的组成部分。核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不可缺少的组成部分。l 核酸是生命遗传信息的携带者和传递者。核酸是生命遗传信息的携带者和传递者。 它不仅对于生命的延续、生物物种遗传特性的保持

4、、生长发育、它不仅对于生命的延续、生物物种遗传特性的保持、生长发育、细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。代谢病等也密切相关。l 因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。Company L年Miescher博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时, 发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物, 并在所有细胞的核里都找到了此物质, 故命名核质核质(Nuclein)。一、核酸一、核酸研究简史研究简史年Kossel经过10年的努力, 搞清楚

5、核质中有四种不同的组成部分: A,T, C和G。 年Altman建议将核质改名为“核酸核酸”, 并且已经认识到“核质” 乃“核酸” 与蛋白质的复合体。Company L年Levene发现酵母的核酸含有核糖。 年Levene发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖即脱氧核糖, 得出了一个错误概念: 植物核酸含核糖,动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚RNA和DNA的区别。Levene还提出了核酸的“磷酸-核糖(碱基)-磷酸”的骨架结构, 解决了DNA分子的线性问题, 还在1935年提出“四核苷酸”学说, 认为这四种核苷酸的聚合体是构成核酸的基本单位。Company L 1

6、9441944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，证明DNA是遗传物质。 19521952年Hershey & Chase的噬菌体感染实验进一步证明DNA是遗传物质。Company Lv 1950年年Chargaff，E和和Hotchkiss，R.D.采用纸层析法仔细分析采用纸层析法仔细分析了了DNA的组成成分，得知的组成成分，得知A=T，G=C，A+G=C+T。v 1953年年Watson，Crick根据根据DNA的的X射线图谱的研究结果，提出射线图谱的研究结果，提出了了DNA的双螺旋模型的双螺旋模型(Double helix)。几星期后提出了半保留式。几星期后

7、提出了半保留式复制模型。复制模型。v 1957年年Meselson Stahl用密度梯度超离心法，证实半保留复制用密度梯度超离心法，证实半保留复制假说。假说。v 1958年年Kornberg得到高纯度的得到高纯度的DNA polymerase，这种酶需，这种酶需要一个模板要一个模板DNA。v 1960年年Cairns拍摄了复制中的细菌拍摄了复制中的细菌DNA的电镜照片。的电镜照片。v 1966年年Nirenberg破译了遗传密码。破译了遗传密码。v 1970年发现第一个年发现第一个DNA限制性内切酶。限制性内切酶。v 1972年建立年建立DNA重组技术。重组技术。v 1978年建立年建立DNA

8、的双脱氧测序法。的双脱氧测序法。v 1990年开始实施人类基因组计划。年开始实施人类基因组计划。v 2003年人类基因组计划宣告完成测序任务。年人类基因组计划宣告完成测序任务。Company L二、核酸的分类及分布、功能二、核酸的分类及分布、功能(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸 90%90%以上分布于细胞核，其余分布于以上分布于细胞核，其余分布于核外核外如线粒体，叶绿体，质粒等。如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。分布于胞核、胞液。携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定

9、细胞和个体的基因型体的基因型(genotype)。参与细胞内参与细胞内DNA遗传信息的表遗传信息的表达。某些病毒达。某些病毒RNA也可作为遗也可作为遗传信息的载体。传信息的载体。Company L（二）核酸的生物功能（） DNA是主要的遗传物质 1928年Griffith的细菌转化实验Company L 1944年，年，Avery 的的“肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验”证证明明DNA是生物体的遗传物质。是生物体的遗传物质。图图 Avery-Macleod-McCarty 实验实验Company L 1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，证明DNA是遗传物质。但

10、人们对此持怀疑态度，理由是： （1）因认为蛋白相对分子质量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA相对分子质量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。 （2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。 （3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。Company L1952年Hershey and Chase的实验进一步证明DNA是遗传物质Company Lv RNA 参与蛋白质合成参与蛋白质合成vRNA功能的多样性功能的多样性 1.某些病毒的遗传物质(

11、RNA病毒，逆转录病毒）; 2.控制蛋白质的合成(mRNA,tRNA,rRNA); 3.遗传信息的加工(snRNA:hnRNAmRNA); 4.基因表达和细胞功能的调控(asRNA,RNAi); 5.催化功能(Ribozyme); 6.在细胞分化和个体发育中发挥重要作用; 7.在生命起源中可能有重要作用。Company LCompany L主要元素组成：主要元素组成： C、H、O、N、P(911%)与蛋白质比较，核酸与蛋白质比较，核酸一般不含一般不含S，而，而P的含量较的含量较为稳定，占为稳定，占9-11%。 二、基本构成单位：核苷酸二、基本构成单位：核苷酸(nucleotide)书书223页

12、页核苷酸由核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成三部分构成Company L（一）核糖和脱氧核糖一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12-D-2-核糖-D-2-脱氧核糖O核糖 + H +糠醛甲基间苯二酚FeCl3绿色产物绿色产物脱氧核糖 + H+ -羟基-酮戊醛二苯胺蓝色产物蓝色产物RNA和和DNA定性、定量测定定性、定量测定Company L（二）嘌呤碱和嘧啶碱（二）嘌呤碱和嘧啶碱N9是成苷位置是成苷位置Company LN1是成苷位置是成苷位置Company Ll 嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（260 nm左右）。Co

13、mpany LCompany L修饰碱基（稀有碱基）修饰碱基（稀有碱基） 多数为主要碱基的修饰产物或代谢产物多数为主要碱基的修饰产物或代谢产物, ,在体在体内含量甚少的碱基，。内含量甚少的碱基，。 tRNA中大约有中大约有10%的稀有碱基。的稀有碱基。Company L( I ) ( m1I )( m22,2G )( m1G )( A )( G )Company L嘧啶碱基嘧啶碱基（C）（U）( T )(hm5C )(m5C )（D）Company LCompany Ll 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2N

14、NNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2核糖核苷：核糖核苷：AR, GR, UR, CRAR, GR, UR, CR脱氧核苷：脱氧核苷：dARdAR, , dGRdGR, , dTRdTR, , dCRdCR（三）Company L连接方式： 戊糖 C1-OH H-N9 嘌呤碱基 戊糖 C1-OH H-N1 嘧啶碱基 Company L（四）核苷酸（四）核苷酸 （nucleotide）HHHHHHH H H1、核苷酸的结构和命名：、核苷酸的结构和命名： 核苷酸核苷酸 核苷核苷+磷酸磷酸 戊糖戊糖+碱基碱基

15、+磷酸磷酸Company L核苷酸核苷酸( (ribonucleotideribonucleotide) )的结构与命名的结构与命名核苷和磷酸以核苷和磷酸以磷酸酯键磷酸酯键连接连接Company LCompany LCompany LCompany LCompany L 2、核苷酸的其他形式、核苷酸的其他形式n多磷酸核苷（多磷酸核苷（NDP、NTP)n环化核苷酸（环化核苷酸（cAMP、cGMP等）等）n辅酶或辅基（辅酶或辅基（NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有等，均含有AMP），），n活性代谢物（活性代谢物（UDPG、CDP-胆碱，等）胆碱，等） Company LCompany LA

16、TPATP的性质的性质v ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。v ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。v ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。Company LcAMPcAMP和和cGMPcGMPv cAMP(3,5-环化腺苷酸)和cGMP(3,5-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。v cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4, cAM

17、P和cGMP的水 解 能 约 为 4 3 . 9 KJ/mol，比ATP水解能高得多。Company LCompany LCompany LCompany L一、一级结构（一、一级结构（primary structure）一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。1、核苷酸的连接方式：、核苷酸的连接方式： 3 , 5 磷酸二酯键磷酸二酯键2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链、核酸的基本结构形式：多核苷酸链n信息量：信息量：4nn末端：末端： 5 端、端、 3 端端n多核苷酸链

18、的方向：多核苷酸链的方向： 5端端3端端(由左至右由左至右)3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写、表示方法：结构式、线条式、文字缩写Company LCompany L 二、二、DNA的空间结构的空间结构（一）（一）DNA的二级结构（的二级结构（secondary structure）1、碱基组成规则、碱基组成规则(Chargaff规则规则)nA=T，G=C； A+G=T+C(嘌呤与嘧啶的总数相等嘌呤与嘧啶的总数相等)n有种属特异性有种属特异性n无组织、器官特异性无组织、器官特异性n不受年龄、营养、性别及其他环境等影响不受年龄、营养、性别及其他环境等影响 Company Lv DNA分子由两

19、条DNA单链组成。v DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。v 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。DNADNA双螺旋结构的特点双螺旋结构的特点double helix modelCompany LDNADNA双螺旋结构的要点双螺旋结构的要点（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5端3端，而另一条链的方向为3端5端。Company L（2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环

20、平面成90角。Company L（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4 nm。Company L（4）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。v在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。Company L（5）螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别D

21、NA碱基序列的基础。（6）氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。Company L（二）二级结构：（二）二级结构： 双螺旋结构模型双螺旋结构模型(double helix model)1、Watson-Crick双螺旋结构模型双螺旋结构模型(B-DNA) （1）反平行双链：脱氧核糖）反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧碱基对位于内侧 （2）碱基互补配对：）碱基互补配对：AT配对（两个氢键），配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴（3）右手双螺旋：螺距为）右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直

22、径为，直径为2.0 nm，10bp/圈圈Company L（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别白质识别DNA碱基序列的基础碱基序列的基础 （5）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定3、其他螺旋形式、其他螺旋形式n Z-DNA（左手双螺旋）（左手双螺旋）n A-DNACompany L DNA double helix类型类型 helix type bp/turn rotation/bp vertical rise/bp helical d A

23、 11 +34.7 2.56A 23A B 10 +34.0 3.38A 19A C 9.33 +38.6 3.32A 19A Z 12 -30.0 5.71A 18ACompany LCompany LCompany LDNADNA双螺旋的稳定性双螺旋的稳定性v DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。v 维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键，碱基堆积力。v 双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；v 介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力等。v 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。Com

24、pany L 天然存在的天然存在的DNA分子最显著的特分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在点是很长，分子质量很大，一般在1061010。l大肠杆菌染色体由大肠杆菌染色体由400万碱基对万碱基对(basepair，bp)组成的双螺旋组成的双螺旋DNA单单分子。其长度为分子。其长度为1.4106nm，相当于，相当于1.4mm，而直径为，而直径为20nm，相当原子，相当原子的大小。的大小。l黑腹果蝇最大染色体由黑腹果蝇最大染色体由6.2107bp组成，长组成，长2.1cml多瘤病毒的多瘤病毒的DNA由由5100bp组成组成 ，长长1.7mmCompany L DNA 的三级结构是指DNA分子

25、（双螺旋）通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。 超螺旋是DNA三级结构的一种形式。Company L大多数原核生物大多数原核生物 ：1 1）共价封闭的环状）共价封闭的环状双螺旋分子双螺旋分子2 2）超螺旋结构：双）超螺旋结构：双螺旋基础上的螺旋化螺旋基础上的螺旋化正超螺旋正超螺旋(positive (positive supercoilsupercoil):):盘绕方向盘绕方向与双螺旋方同相同与双螺旋方同相同负超螺旋负超螺旋(negative (negative supercoilsupercoil):):盘绕方

26、向盘绕方向与双螺旋方向相反与双螺旋方向相反 Company LCompany L（三）（三）DNA在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装核小体核小体(nucleosome)： 由由DNA和组蛋白构成。和组蛋白构成。DNA：以负超螺旋缠：以负超螺旋缠绕在组蛋白上绕在组蛋白上组蛋白核心：组蛋白核心：H2B ,H2A ,H3 ,H4H2B ,H2A ,H3 ,H4H1H1组蛋白在核小体之间组蛋白在核小体之间Company LCompany L核小体的核小体的结构：结构： H2A H2B H3 H4 各各2分子分子 H1 1分子分子组蛋白八聚体：组蛋白八聚体： DNA盘绕八聚体盘绕八聚体1.

27、8圈，圈，共共146bp, 中间连接中间连接60bp，每个核小体重复单位约占每个核小体重复单位约占DNA 200bp。Company LCompany LCompany LDNA双螺旋双螺旋核小体，压缩核小体，压缩 7螺线管，压缩螺线管，压缩6襻，压缩襻，压缩40 螺旋圈螺旋圈 压缩压缩576405 = 8400突环突环Company L（三）（三）DNA的功能的功能DNA的基本功能是以的基本功能是以基因基因的形式荷载遗的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。

28、的信息基础。基因从结构上定义，基因从结构上定义，是指是指DNA分子中的分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。因的功能。 Company L三、三、RNA的分子结构的分子结构Company LRNARNA的结构特点的结构特点v RNA是单链分子，因此在RNA分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。v RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。v 在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同

29、类型的RNA, 其二级结构有明显的差异。v tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分.Company LCompany L（一）信使（一）信使RNA的结构与功能的结构与功能* * 真核生物真核生物mRNA的的结构特点结构特点1. 大多数真核大多数真核mRNA的的5 末端均在转录后加上末端均在转录后加上一个一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C 2也也是甲基化，形成帽子结构：是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。2. 大多数真核大多数真核mRNA的的3 末端有一个多聚腺苷酸末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚结构，称

30、为多聚A尾。尾。Company LhnRNA 内含子内含子( (intron) )mRNA 外显外显子子( (exon) )* 真核生物真核生物mRNA成熟过程成熟过程Company LmRNAmRNA核内向胞质的转位核内向胞质的转位mRNAmRNA的稳定性维系的稳定性维系翻译起始的调控翻译起始的调控 帽子结构和多聚帽子结构和多聚A尾的功能尾的功能Company L* mRNA的功能的功能 把把DNA所携带的遗传信息，按碱基互所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。DN

31、AmRNA蛋白蛋白转录转录翻译翻译原核细胞原核细胞 细胞质细胞质细胞核细胞核DNA内含子内含子外显子外显子转录转录转录后剪接转录后剪接转运转运mRNAhnRNA翻译翻译蛋白蛋白真核细胞真核细胞 Company L（二）（二）tRNA的结构与功能的结构与功能* tRNA的一级结构特点 含含 1020% 稀有碱基，如稀有碱基，如 DHU 3 末端为末端为 - CCA-OH 5 末端大多数为末端大多数为G 具有具有 T C NHNHOOHHHH双氢尿嘧啶双氢尿嘧啶(DHU)假尿嘧啶假尿嘧啶( )次黄嘌呤次黄嘌呤(I)Company L* tRNA的二级结构的二级结构三叶草形三叶草形 氨基酸臂氨基酸臂

32、 DHU环环 反密码环反密码环 额外环额外环 TC环环氨基酸氨基酸臂臂额外环额外环Company LCompany L* tRNA的功能：的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。参与蛋白质的翻译。Company L1、分子较小，含较多的稀有碱基和非标准碱基配对、分子较小，含较多的稀有碱基和非标准碱基配对2、5端一般为鸟嘌呤核苷酸，端一般为鸟嘌呤核苷酸，3端为端为CCA-OH3。3、二级结构为、二级结构为“三叶草三叶草”型（型（cloverleaf pattern）小结小结n反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与mRNA

33、的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗传密码，称为反密码子（传密码，称为反密码子（anticodon）。）。I常出现常出现于反密码子中于反密码子中Company LACCDHU环环T 环环反密码环反密码环5额外环额外环n氨基酸臂：氨基酸臂：3末端的末端的CCA-OH3单链单链用于连接该用于连接该tRNA转运的氨基酸。转运的氨基酸。 n二氢尿嘧啶环（二氢尿嘧啶环（DHU）：识别）：识别氨酰氨酰-tRNA合成酶合成酶nTC环：识别核蛋白体（核环：识别核蛋白体（核糖体）糖体）4、“倒倒L”型三级结构型三级结构Company L（三）（三）rRNA的结构与功能的结构与

34、功能原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的30%49种占总重量的35%核蛋白体的组成核蛋白体的组成* rRNArRNA的功能的功能: :组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。Company L（四）其他小分子（四）其他小分子RNA及及RNA组学组学除了上述三种除了上述三种RNA外，

35、细胞的不同部位存在外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子的许多其他种类的小分子RNA，统称为，统称为非非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或或非编码蛋白质的非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。 种类：种类：核内小核内小RNARNA；核仁小；核仁小RNARNA；胞质小；胞质小RNARNA；催化性小催化性小RNARNA；小片段干涉；小片段干涉 RNARNA功能：功能：参与参与hnRNA和和rRNA的加工和转运。的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的在在基因表达以及应激信号传

36、导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。）。 Company L小片段干扰小片段干扰RNA RNA （siRNAsiRNA；又称；又称“引导引导RNAsRNAs”，guide guide RNAsRNAs）：一些小的双链）：一些小的双链RNARNA可以高效、特异可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使的阻断体内特定基因表达，促使mRNAmRNA降解，诱使细降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNARNA干扰（干扰（RNA RNA interferenceinterfe

37、rence，RNAiRNAi，也译作，也译作RNARNA干预或干涉）。干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。Company LRNAiRNAi的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。（1 1）在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的）在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链双链RNARNA进行切割，产生具有特定长度（进行切割，产生具有特定长度（19-19-21nt21nt）和序列的小片段）和序列的小片段RNARNA；（2 2）在）在RNAiRNAi效应阶段，效应阶段，siRNAsiRNA双链结合一个核双链结合一

38、个核酶复合物从而形成所谓酶复合物从而形成所谓RNARNA诱导沉默复合物诱导沉默复合物（RISCRISC）。激活）。激活RISCRISC需要一个需要一个ATPATP依赖的将依赖的将siRNAsiRNA解双链的过程。激活的解双链的过程。激活的RISCRISC通过碱基配对通过碱基配对定位到同源定位到同源mRNAmRNA转录本上，并在距离转录本上，并在距离siRNA3siRNA3端端1212个碱基的位置切割个碱基的位置切割mRNAmRNA。Company LRNARNA组学研究细胞中组学研究细胞中snmRNAs的种类、的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、结构和功能。同一生物体内不同种类的细

39、胞、同一细胞在不同时间、不同状态下同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。的表达具有时间和空间特异性。 RNARNA组学组学: :Company LCompany L 一、酸性化合物一、酸性化合物n 两性解离，但酸性强两性解离，但酸性强n 电泳行为电泳行为泳向正极（泳向正极（pH7-8） 二、高分子性质二、高分子性质n 粘度粘度 DNARNAn 超离心沉降超离心沉降n 凝胶过滤凝胶过滤n 分子大小单位：分子量（道尔顿，分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、）、碱基对数目（碱基对数目（bp）、离心沉降常数（）、离心沉降常数（S） n 沉淀行为沉淀行为加盐（中和电荷）

40、；乙醇加盐（中和电荷）；乙醇Company L紫外吸收紫外吸收Company L1. DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50 g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0OD260的应用的应用Company L 三、紫外吸收三、紫外吸收n 最大吸收波长：最大吸收波长：260nmn 核酸定量分析核酸定量分析n 核酸定性分析核酸定性分析 四、变性、复性、分子杂交四、变性、复性、分子杂交

41、1、DNA变性（变性（DNA denaturation）：）：DNA变性变性是指在理化因素作用下，是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。形成单链的过程。 Company LDNA的变性的变性(denaturation)方法：方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：ODOD260260增高；粘度下增高；粘度下降；比旋

42、度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变线改变；生物活性改变DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂Company LDNADNA变性变性Company L增色效应：增色效应：DNADNA变性时其溶液变性时其溶液ODOD260260增高的现象。增高的现象。Company Lv 当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 80 90 100 100%50%OD260（254） Tm 变性温度范围变性温度范围融解温度（melting temperature,Tm）：DN

43、A热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）或解链温度、变性温度。 实验室常用的方法实验室常用的方法热变性热变性Company L影响影响TmTm值的因素值的因素(1)(1)溶液的性质溶液的性质(2)DNA(2)DNA的性质和组成的性质和组成大肠杆菌大肠杆菌DNADNA在不同浓度在不同浓度KClKCl溶液下的溶液下的熔融温度曲线熔融温度曲线Company LnGC含量越高，含量越高，Tm越大越大Company L （1）变性后理化性质改变）变性后理化性质改变nDNA溶液的粘度降低溶液的粘度降低n浮力密度增加浮力密度增加n旋光偏振光改变旋光偏振光改变n紫外吸收增加（高

44、色效应）紫外吸收增加（高色效应）高色效应（高色效应（hyperochromic effect）：）：DNA变变性后，在性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。应或增色效应。 （2）变性后的）变性后的DNA一级结构没有改变。一级结构没有改变。Company L（3）融解温度（）融解温度（melting temperature,Tm）：）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（时溶液的温度称为融解温度（Tm）GC含量越高，含量越高，Tm越大越大DNA越长，越长，Tm越大越大溶液离子

45、强度增高，溶液离子强度增高，Tm值增加值增加DNA越纯，相变范围越小越纯，相变范围越小 Company L2、DNA复性复性DNA复性复性(renaturation)的定义的定义:在适当条件下，在适当条件下，变性变性DNADNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为这一现象称为复性复性。热变性的热变性的DNADNA经缓慢冷却后即可复性，这一过经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为程称为退火退火(annealing)(annealing) 。减色效应减色效应（hypochromic effect ）:DNA复性时，复性时，其溶液其溶液OD260降低。降低

46、。Company LDNADNA复性复性Company L在在DNA变性后的复性过程中，如果将不变性后的复性过程中，如果将不同种类的同种类的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可以在不同的DNA与与DNA之间形成，也可以在之间形成，也可以在DNA和和RNA分子间或者

47、分子间或者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为分子间形成。这种现象称为核酸核酸分子杂交分子杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization) Company L核酸核酸的杂的杂交交Company LCompany LDNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用: :研究基因的位置研究基因的位置确定两种核酸序列的相似性确定两种核酸序列的相似性检测样品中的特异序列检测样品中的特异序列基因芯片技术的基础基因芯片技术的基础 Company L核酸探针（核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一能特异性的探测带某一特定序列的特定序列的DNA或或RNA分子的标记核酸分子。分子的标记核酸分子。Company L3、核酸分子杂交、核酸分子杂交(hyb