实验四SDS-PAGE电泳1

1、实验四实验四 蛋白质分子蛋白质分子量的测定量的测定 SDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳法v聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）是根据）是根据被分被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，的不同，在电场的作用下，产生不同的移动在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。它具有速度而分离的方法。它具有电泳和分子筛电泳和分子筛的的双重作用。双重作用。 一、实验原理一、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE) ，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进引进SDS（十二烷基硫酸

2、钠）。（十二烷基硫酸钠）。SDS是阳离子去污剂，作用有四：去是阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。（空间构象破坏）折叠。（空间构象破坏） 蛋白质与蛋白质与SDS分子按比例分子按比例(1.4gSDS/g蛋蛋白质白质)结合，形成结合，形成带负电荷带负电荷的的SDS-蛋白质蛋白质复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷原有的电荷,因而因而降低或消除降低或消除了各种蛋白了各种蛋白质分子之间质分子之间天然的电荷差异天然的电荷差异，由于，

3、由于SDS与与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决迁移速度取决于分子大小于分子大小。 带负电荷带负电荷的的SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物当分子量在当分子量在15KD到到200KD之间时，蛋白质的之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：符合下式： logMW=K-bX，式中：式中：MW为分子量，为分子量，X为迁移率，为迁移率，k、b均为均为常数。常数。若将若将已知分子量的标准蛋白质已知分子量的标准蛋白质的迁移率对的迁移率对分子分子量对数作图量对数作图

4、，可获得一条，可获得一条标准曲线标准曲线，未知蛋白，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在率即可在标准曲线上求得分子量。标准曲线上求得分子量。SDS-PAGE SDS-PAGE 标准曲线标准曲线相相对对分分子子量量相对迁移率相对迁移率二、凝胶的原理二、凝胶的原理v聚丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂 N ， N 亚甲基双丙烯酰胺（Bis 在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。 v双丙烯酸铵决定交联形成的程度，丙烯酰胺决定决定交联的长度常用的催化剂（包括催化剂和加

5、速剂）常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）（1）过硫酸铵）过硫酸铵 (AP) TEMED （四甲基乙二（四甲基乙二胺）系统胺）系统在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵 （NH4）2S2O8 产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行（pH8.8)。 （ 2 ）核黄素）核黄素 TEMED 系统系统v 这是一个光激发的催化反应。核黄素在光照下分解，被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。 凝胶的浓度：凝胶的浓度：v常用的所谓标准胶是指浓度为

6、7.5 的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此胶中电泳都能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用 7.5 的标准凝胶或用4 10的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。 SDS-PAGE电泳系统有两种电泳系统有两种：（1）连续聚丙烯酰胺电泳系统：）连续聚丙烯酰胺电泳系统：凝胶全部有分离胶组成，凝胶全部有分离胶组成，不具备浓缩效应。不具备浓缩效应。（2）不连续的聚丙烯酰胺电泳系统：）不连续的聚丙烯酰胺电泳系统： 有浓缩胶和分离胶组成。有浓缩胶和分离胶组成。 通过浓缩效应、电荷效应和分子筛效应通过浓缩效应、电荷效应和分子筛效应 ，使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢

7、离子之间子之间浓缩成一薄层浓缩成一薄层，有利于提高电泳，有利于提高电泳的分辨率。的分辨率。三、三、 所用试剂：所用试剂： vAcr（acrylamide）/Bis 储备液储备液v10% (w/v) SDS ：vTEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺)v过硫酸铵过硫酸铵 (AP):10%现配现用现配现用vTrisHCL缓冲系统，缓冲系统，v分离胶缓冲液分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8）v浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8v电极泳缓冲液：电极泳缓冲液：使用的使用的Tris甘氨酸缓冲系统：甘氨酸缓冲系统：pH 8.3内含内含

8、SDSv样品缓冲液（样品缓冲液（62.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8 ）v染色液（考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝 R-250）v脱色液：（脱色液：（ 甲醇：冰醋酸：水甲醇：冰醋酸：水=4：1：5）v溴粉兰：溴粉兰：0.1%四、实验步骤四、实验步骤l. 贮液配制：贮液配制： v应注意：应注意：（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放可放 l 2 个月。个月。 （2）过硫酸铵应当天配制。）过硫酸铵应当天配制。 （3）如有不溶物要过滤。）如有不溶物要过滤。 （4）显色液用前再混和。）显色液用前再混和。 （5）电极缓冲液用时稀释）电极缓冲液

9、用时稀释 10 倍。倍。 2. 安装夹心式垂直板电泳槽安装夹心式垂直板电泳槽 3.配胶：配胶：采用不连续系统采用不连续系统（1）分离胶的制备（）分离胶的制备（10ml，12%）：）： 蒸馏水蒸馏水 3.4ml Acr/Bis储备液储备液 4.0ml 分离胶缓冲液分离胶缓冲液 2.5ml 10% SDS 100l 10% APS 50l TEMED 5l按上述配方依次加入各种溶液，充分摇匀后灌按上述配方依次加入各种溶液，充分摇匀后灌入制胶架中。入制胶架中。 （2）浓缩胶的制备（）浓缩胶的制备（5ml，5%） 蒸馏水蒸馏水 2.85mlAcr/Bis储备液储备液 0.85ml浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲

10、液 1.25ml10% SDS 50l10% APS 25lTEMED 5l在灌入浓缩胶后插入样品梳。在灌入浓缩胶后插入样品梳。 4. 样品的处理及点样：样品的处理及点样： 将提取的蛋白质（或标准蛋白）中加入等体将提取的蛋白质（或标准蛋白）中加入等体积的上样缓冲液，混匀，置于沸水浴中加热积的上样缓冲液，混匀，置于沸水浴中加热5min，冷却后经，冷却后经10000rpm离心离心15min，取，取上清液点样。上清液点样。5.电泳：电泳：将制好胶的电泳槽放入底座中，加入电极缓冲将制好胶的电泳槽放入底座中，加入电极缓冲液，上层液中加入溴粉兰指示剂，连接好电泳液，上层液中加入溴粉兰指示剂，连接好电泳仪，

11、开始电泳。仪，开始电泳。浓缩胶恒压浓缩胶恒压75V，分离胶恒压，分离胶恒压120V，电泳时间，电泳时间约约90min。6.染色和脱色：染色和脱色：v当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘 1 cm 时，时，电泳结束。电泳结束。v将胶剥离，放入容器中，用蒸馏水清洗将胶剥离，放入容器中，用蒸馏水清洗2-3遍，倒入染色液染色遍，倒入染色液染色2-3h或静置或静置过夜。过夜。染色结束后，用蒸馏水冲洗胶染色结束后，用蒸馏水冲洗胶2-3遍，以清除遍，以清除多余的染料，倒入多余的染料，倒入脱色液脱色液，置于脱色摇床上，置于脱色摇床上脱色，中间换脱色，中间换1-2次脱色液，直至背景色完全次脱色液，直至背景色完全脱掉。脱掉。v附：附： 样品的制备样品的制备 v称取植物材料称取植物材料 1 g ，放入研钵内，加，放入研钵内，加 pH8.0 提取液提取液 1 mL ，于冷水浴中研成匀浆，然后，于冷水浴中研成匀浆，然后