第六章基因重组与基因工程

1、第十七章第十七章 基因重组与基因工程基因重组与基因工程 (genetic recombination(genetic recombination and genetic engineer) and genetic engineer)1基因重组基因重组(genetic recombination)(genetic recombination) 是指在体外用酶学方法将不同来源的是指在体外用酶学方法将不同来源的DNADNA进行切割、连接，进行切割、连接，组成一个新的组成一个新的DNADNA分子的过程，又称分子的过程，又称DNADNA重组重组。基因克隆基因克隆(gene cloning)(gene c

2、loning) 将重组将重组DNADNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一殖，以获得大量的同一DNADNA分子，称此为分子，称此为基因克隆、基因克隆、DNADNA克隆克隆或分子克隆或分子克隆。基因工程基因工程(genetic engineering)(genetic engineering) 是将不同来源的是将不同来源的DNADNA片段与载体分子连接形成重组片段与载体分子连接形成重组DNADNA分子，分子，再导入宿主细胞内进行表达，也称再导入宿主细胞内进行表达，也称重组重组DNADNA技术技术。2 本章主要内容本章主要内容 重要

3、的工具酶重要的工具酶 基因克隆常用的载体基因克隆常用的载体 重组重组DNADNA基本原理基本原理 重组技术在医学和制药重组技术在医学和制药 工业中的应用工业中的应用3第一节第一节 重要的工具酶重要的工具酶工工具酶具酶 基因基因工程中的工具酶主要包括工程中的工具酶主要包括用于用于DNADNA和和RNARNA分子分子的的切割切割、连接连接、聚合聚合、逆、逆转录转录等等相关相关的各种酶类的各种酶类。4一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能专一识别和是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链切割双链DNADNA中中的特定碱

4、基序列的核酸内切酶，简称的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。 根据限制酶作用特性，一般分为根据限制酶作用特性，一般分为、和和型，型， 其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。 5 限制酶（限制酶（型）识别及切割位点型）识别及切割位点 特异识别及切割特异识别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的DNADNA片断，主要产生片断，主要产生3 3种末端结构：种末端结构： 55粘性末端粘性末端 33粘性末端粘性末端 平端或钝端平端或钝端 回文序列回文序列(palindrome)(palindrome) 是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷

5、酸序列呈180180O O反向重复反向重复; ; 粘性末端粘性末端(sticky end)(sticky end) 是指经内切酶特异切割后产生的是指经内切酶特异切割后产生的55末端突出和末端突出和33末端突出的碱基序列相互间具有互补性末端突出的碱基序列相互间具有互补性。6 产生产生5-5-粘性末端粘性末端-G-CTTAA53AATTC-G-35-G-CTTAA53AATTC-G-35+EcoR I 产生产生3-3-粘性末端粘性末端-CTGCA-G53G-ACGTC-35-CTGCA-G53G-ACGTC-+Pst I357 产生平产生平( (头末头末) )端端/ /钝端钝端5-CCC3-GGG

6、GGG-3CCC-5+Sma I5-CCC3-GGGGGG-3CCC-5其它特殊性质其它特殊性质的的型限制酶型限制酶同裂酶（同裂酶（异源同工酶异源同工酶）同尾酶同尾酶可变酶可变酶8同裂酶同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的相同的识别识别序列序列。 在切割在切割DNADNA时，其时，其切割点切割点可以是可以是相同相同的，产生的，产生平头末端，称为平头末端，称为同识同切同识同切； 切割点切割点也可以是也可以是不同不同的，产生的，产生33或或55粘性末粘性末端，称为端，称为同识异切同识异切。 9同裂酶同裂酶同识同识同同切切5-TTT3-AAAAAA-3T

7、TT-5+Aha Dra 5-TTT3-AAAAAA-3TTT-510同裂酶同裂酶同识同识异异切切GCCATGGTACCGGGTACCCCATGGGGTACCCCATGG+Kpn I5-G3-CCATGGTACC-3G-5+Asp718 I5-3-3-55-3-3-55-3-3-511同同 尾尾 酶酶GCCTAGGATCCGGATCCTAGGATCCTAG5-3-3-5Mbo BamH Bgl5-3-3-55-A3-TT-3A-5 同尾酶同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后性的一类酶。它们作用后产生相同产生相同的的粘性粘

8、性末端末端。12可变酶可变酶可变酶可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过并且识别顺序往往超过6 6个碱基对。个碱基对。 如，如， BstBstp p，其识别顺序为其识别顺序为GGTNACCGGTNACC。13 常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciens H解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia col

9、i RY13大肠杆菌大肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuProvidencia stuartii 164普罗威登细菌普罗威登细菌PstCTGCAGSalpStreptomyces albusSubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌SalGTCGACAvaXho14 限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用 通过切割不同来源通过切割不同来源DNA双链的特异碱双链的特异碱基序列，基序列，产生产生含有黏性末端或平端的、长含有黏性末端或平端的、长度不同的度不同的DNA片段。片段。 用于用于DNA重

10、组、制备探针、分子杂交、重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。序列分析等。15二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 （最常用的最常用的DNADNA聚合酶有以下聚合酶有以下4 4种种） DNADNA聚合酶聚合酶（全酶）（全酶） DNADNA聚合酶聚合酶大片段大片段KlenowKlenow片段片段 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 T T4 4 噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶16 DNADNA聚合酶聚合酶 E.ColiE.Coli DNADNA聚合酶聚合酶（DNA DNA polpol ） 是一个具有是一个具有3 3 种酶活性的多功能性酶。种酶活性的多功能性酶。包括：包括： 5 5

11、33DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性 5 533核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 355核酸外切酶活性核酸外切酶活性17 DNA DNA polpol 应用应用 常用来常用来催化催化DNADNA缺口平移反应，制备高比活性缺口平移反应，制备高比活性DNADNA 探针探针； cDNAcDNA第二条链的合成；第二条链的合成； 对对DNA3DNA3 突出末端进行标记；突出末端进行标记； DNADNA序列分析。序列分析。18E. coliE. coli DNA DNA polpol. . 催化缺口平移催化缺口平移*T*T*T*TMg2+D N a s e I53353 5533553355335dA

12、TP,dCTP,dGTP-32P dTTPE. coli DNA POL I19 KlenowKlenow片段（片段（DNA DNA polpol. .大片断）大片断）20 KlenowKlenow片段用途片段用途 补齐双链补齐双链DNADNA的的 33末端；末端； 用标记碱基补用标记碱基补 齐齐3 3末端末端 ； 聚合酶Klenow DNA -32PdNTP双链DNA粘端5-外切酶变性+5335353533555533标记探针标记末端 用于用于cDNAcDNA克隆中克隆中第二股链的合成第二股链的合成； DNADNA序列分析。序列分析。21 TaqTaq DNA DNA polpol（耐热（耐

13、热DNADNA聚合酶）聚合酶） 作用作用特点特点1 1） TaqTaq DNA DNA polpol催化催化DNADNA合成的最适温度范围合成的最适温度范围 70 70 7575，2 2） 9595以上高温，半小时不失活，以上高温，半小时不失活， 3 3） 最适合用于最适合用于聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）。 22三、逆转录酶三、逆转录酶(reverse transcriptase) 特点特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3 3种酶种酶活性：活性： 以单链以单链RNARNA为模板，为模板， 催化合成催化合成cDNAcDNA单链单链 具

14、有具有RNaseRNase H H 活性，能水解活性，能水解RNA:DNARNA:DNA杂交链中的杂交链中的 RNARNA 以以DNADNA为模板，为模板，催化合成催化合成cDNAcDNA双链。双链。23 逆转录酶的应用：逆转录酶的应用： 将将mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA，构建构建cDNAcDNA文库文库； 补平和标记补平和标记5 5- -末端突出的末端突出的DNADNA片段；片段； 代替代替KlenowKlenow酶用于酶用于DNADNA序列分析；序列分析； 制备杂交探针等。制备杂交探针等。24四、四、DNADNA连接酶连接酶(DNA (DNA ligaseligase)

15、 ) 催化双链催化双链DNADNA中一条链的中一条链的33OHOH与另一条链的与另一条链的55POPO3 3H H2 2形成磷酸二酯键，从而构成完整的形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNADNA长长链。链。 DNADNA连接酶的用途连接酶的用途（1 1） 两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接起来5- ACG AATTCGT-3 5- ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 5-ACGAATTCGT-35-ACGAATTCGT-33- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-53- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2 2

16、） 修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子分子T4DNA连接连接酶酶25五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能够催化水解去除能够催化水解去除DNADNA或或RNA5-RNA5-端的磷酸基团。端的磷酸基团。用途用途 制备载体制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 55端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。高重组效率。 用用3232P P标记标记5-5-端前，去除端前，去除5-P5-P，再通过激酶作用再通过激酶作用把放射性核苷酸加到把放射性核苷酸加到5-5-端进行

17、标记端进行标记。26六、末端六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶（脱氧核苷酸）转移酶( (TdTTdT) ) 作用作用 将标记或未标记的将标记或未标记的dNTPdNTP加到加到DNADNA的的3OH3OH末端；也可催末端；也可催化载体分子或待克隆的化载体分子或待克隆的DNADNA片段上加上互补的同聚尾，便于进片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。一步连接。应用应用 探针标记探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接3 3 3 3 27重要的工具酶重要的工具酶工具酶

18、工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列，切割识别特异碱基序列，切割DNA DNA T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5- -磷酸与磷酸与3 3- -羟基羟基 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成cDNAcDNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除切除5 5 末端磷酸末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚尾

19、端合成同聚尾28第二节第二节 基因克隆常用的载体基因克隆常用的载体载体载体(vector)(vector) 是指能在连接酶作用下和外源是指能在连接酶作用下和外源DNADNA片段连接起来，并运送片段连接起来，并运送到宿主细胞的运载工具。到宿主细胞的运载工具。 其化学本质为其化学本质为DNADNA分子分子 。 本节主要内容本节主要内容 载体必须具备的基本条件载体必须具备的基本条件 载体的分类载体的分类 常用的载体常用的载体29一、载体必须具备的基本条件一、载体必须具备的基本条件 具有独立复制能力具有独立复制能力 具备多个限制酶的识别位点具备多个限制酶的识别位点( (多克隆位点多克隆位点) ) 具有

20、具有遗传表型或遗传表型或筛选筛选标记标记 有有足够的容量足够的容量以容纳外源以容纳外源DNADNA片段片段 可导入受体细胞。可导入受体细胞。30二、载体的分类二、载体的分类*（一）（一） 克隆载体克隆载体 用来克隆和扩增用来克隆和扩增DNADNA片段的载体。片段的载体。 有质粒有质粒DNADNA、噬菌体、噬菌体DNADNA和病毒和病毒DNADNA三类三类。 （二）（二） 表达型载体表达型载体 为了使插入的外源为了使插入的外源DNADNA能够表达为多肽链而设计能够表达为多肽链而设计的载体称为的载体称为表达型载体表达型载体。 表达型载体表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的除需载体必备条件外，还

21、需相应的启启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控等表达调控构件。构件。31三、常用的载体三、常用的载体 （一）（一） 质粒质粒 (plasmid)(plasmid)： 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状状DNADNA分子。分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点：作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1. 1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内， 有较高的拷贝数；有较高的拷贝数； 2. 2. 具有具有1 1个以上的遗传标志，便于筛选；个以上的遗传标志，便于筛

22、选； 3. 3. 具有多克隆位点。具有多克隆位点。 32 总而言之，质粒载体应该是一种分子量总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的较小、高拷贝的“松弛型松弛型”质粒，且具有一质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：广泛应用的质粒： pBR32质粒、质粒、pUC系列等系列等33 pBR322pBR322质粒质粒 4363 4363 bpbp 含一个复制点含一个复制点含一个抗氨卞青霉素基因含一个抗氨卞青霉素基因( (ampampR R) ) 一个抗四环素基因一个抗四环素基因 ( (tettetR R) ) ampampR R和和t

23、ettetR R抗性抗性基因内各有基因内各有一些限制酶的酶切位点，供一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入外源基因插入 当外源基因插入抗药基当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。因内后，抗药基因失活。AmpAmpR RAmpAmp敏感敏感( (AmpAmpS S ) )、TetTetR RTetTet敏感敏感( (TetTetS S).).34pUC系列质粒系列质粒 由由pBR322pBR322和和M13M13噬菌体构建噬菌体构建而成的双链质粒载体；而成的双链质粒载体；（1 1） 2674bp2674bp；（2 2） 有有ampampR R和与和与M13M13噬菌体噬菌体 相同的多克隆位点（

24、相同的多克隆位点（MCSMCS）（3 3）有）有1 1个来自个来自E.coliE.coli的的LacZLacZ基基因因片断片断, , 编码半乳糖苷酶，编码半乳糖苷酶，便于蓝白筛选便于蓝白筛选35 ( (二二)噬菌体噬菌体 组成特点组成特点： 双链线状双链线状DNADNA分子，分子， 全长全长50kb50kb， 含含6666个基因，个基因， 在其分子两端各含有在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链，是个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为天然的粘性末端，被称为COSCOS位点位点。36 噬菌体两种生长途径（示意图）噬菌体两种生长途径（示意图）37 噬菌体感染细菌后的噬菌体感染细菌后的两种

25、生长途径两种生长途径 溶菌性生长溶菌性生长 噬菌体感染细菌后，借助其噬菌体感染细菌后，借助其2 2个个COSCOS位点互补位点互补成环成环，在宿，在宿主菌体内主菌体内连续复制连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，颗粒，裂解宿主菌裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长溶源性生长 噬菌体感染细菌后，可将自身噬菌体感染细菌后，可将自身DNADNA整合整合到细菌的染色体到细菌的染色体中去，与之中去，与之一起复制一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解解 。38

26、第三节第三节 重组重组DNADNA基本原理基本原理 （DNADNA重组基本程序包括下列过程）重组基本程序包括下列过程） 分分获取目的基因和载体获取目的基因和载体 接接目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接 转转重组重组DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞 筛筛重组重组DNADNA的筛选与鉴定的筛选与鉴定39一、目的基因的获取（一、目的基因的获取（分分）目的基因目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。隆或表达的基因。 目的基因来源目的基因来源 1 1） 制备基因组制备基因组DNADNA 2 2） 制备制备cDNAcDNA 3 3） 聚合

27、酶链反应聚合酶链反应 4 4） 人工合成基因人工合成基因40（一）制备基因组（一）制备基因组DNADNA（基因（基因文库，文库， genomic library ）分离、纯化基因组分离、纯化基因组DNADNA 在在EDTAEDTA等存在下，用蛋白等存在下，用蛋白 RERE 酶酶K K消化细胞、酚抽提；消化细胞、酚抽提；大小不同酶切片段大小不同酶切片段 常用蔗糖梯度离心或电泳常用蔗糖梯度离心或电泳 分离酶切片断；分离酶切片断；分别与同样分别与同样RERE酶切的载体连接酶切的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体常用噬菌体载体或质粒载体 DNADNA连接酶连接；连接酶连接； 导入宿主细胞、扩增导入宿主

28、细胞、扩增 导入宿主细胞内培养、扩增；导入宿主细胞内培养、扩增； 得到分子克隆混合体得到分子克隆混合体 用分子杂交等方法进行鉴定、用分子杂交等方法进行鉴定、（基因文库）（基因文库） 筛选、再扩增，分离、回收。筛选、再扩增，分离、回收。 41（二）制备（二）制备cDNA （cDNA文库）文库） 分离目的基因分离目的基因 的的mRNAmRNA逆转录生成逆转录生成cDNAcDNA单链单链 水解去除水解去除mRNAmRNA， 合成合成cDNAcDNA双链双链 水解回折处单链水解回折处单链得到平端双链得到平端双链cDNAcDNA与载体连接，导入宿主细胞扩增与载体连接，导入宿主细胞扩增 构建构建cDNAc

29、DNA文库。文库。42（三）聚合酶链反应（三）聚合酶链反应( PCR)( PCR) 在体外，在体外，以目的基因为模板，在以目的基因为模板，在DNADNA引物、引物、dNTPdNTP、TaqDNATaqDNA PolPol等存在下，构成一个反应体系。经等存在下，构成一个反应体系。经9494变性、变性、5454退火及退火及7272延伸延伸3 3个步骤的反复多次循环（个步骤的反复多次循环（2525 3030次次），扩增目的基因（见），扩增目的基因（见1818章）。章）。 （四）人工合成基因（四）人工合成基因 应用应用DNADNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质测序仪测出某一基因的碱基序

30、列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNADNA合成仪通过化学合成原理合成仪通过化学合成原理合成目的基因。合成目的基因。 （一般先合成短片断一般先合成短片断DNADNA，然后再拼接成长片段，然后再拼接成长片段）43 二、二、 目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（接接） （主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式） 1) 1) 粘性末端连接粘性末端连接 2 2） 平头末端连接平头末端连接 3 3） 人工接头法人工接头法 4 4） 同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法44 （一）（一） 粘性末端连接粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种

31、限制酶酶切，产生将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生 相同粘性末端，再通过相同粘性末端，再通过DNADNA连接酶作用将两者连接起连接酶作用将两者连接起来，构成重组来，构成重组DNADNA分子。分子。 （二）平头末端连接（二）平头末端连接 有些限制酶只能将目的基因和载体有些限制酶只能将目的基因和载体DNADNA切割成切割成平端，此时在平端，此时在T T4 4DNADNA连接酶连接酶的作用下同样能连接起的作用下同样能连接起来。来。45（三）（三） 人工接头法人工接头法 合成合成连接子连接子与与DNADNA平头末端连接平头末端连接限制酶切割限制酶切割, ,产生粘性末端产生粘性末端连接，构建重组连

32、接，构建重组DNADNA。46（四）同源多聚尾连接法（四）同源多聚尾连接法47三、重组三、重组DNADNA导入宿主细胞（导入宿主细胞（转转） 无性繁殖无性繁殖 体外重组后的体外重组后的DNADNA导入导入受体细胞受体细胞，然后随受体细胞，然后随受体细胞生长、增殖，使重组生长、增殖，使重组DNADNA发生复制、扩增，这一过程称发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。为无性繁殖。克隆克隆 从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNADNA的的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。重组体分子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞宿主细胞 进行无性繁殖时所采用的受体细胞进行无性繁

33、殖时所采用的受体细胞. .48 重组重组DNADNA导入导入宿主细胞的宿主细胞的类型类型转化转化 以以质粒质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染转染 以病毒以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导转导 以以噬菌体噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 感受态细胞感受态细胞 用特殊方法处理（用特殊方法处理（CaCL2）后，受体细胞才具备接）后，受体细胞才具备接受外源受外源DNA的能力，的能力， 这种细胞称这种细胞称感受态细胞感受态细胞。 感受态细胞有原核细胞和真核

34、细胞两大类。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。49 四、重组四、重组DNA的筛选与鉴定（的筛选与鉴定（筛筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 1） 平板筛选平板筛选 2） 限制酶切图谱筛选限制酶切图谱筛选 3） PCR筛选重组体筛选重组体 4） 原位杂交技术原位杂交技术插入失活插入失活蓝白筛选蓝白筛选50（一）（一） 平板筛选平板筛选 是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。的方法。 具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（在含抗生素（

35、Amp或或Tet）的培养平板上生长；未转）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。化的则不能生长。1. 插入失活插入失活2. 当外源当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，序列插入质粒中某一抗药基因内，使使3. 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的素的4. 培养平板上。培养平板上。51 抗生素平板筛选抗生素平板筛选（插入失活插入失活）52 2. 2. 蓝蓝- -白白筛选筛选 利用蓝色化合物的形成作为利用蓝色化合物的形成作为指示剂指示剂，筛选带重组质粒的细菌。，筛选带重组质粒的细菌。 载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 编码编码-

36、半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列 -互补互补细菌表达：细菌表达： -半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（ X-gal） 形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当在质粒中当在质粒中插入外源插入外源DNADNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行进行-互补互补产生产生白色菌落白色菌落。 （IPTG 存在下）存在下） 53 蓝蓝白白筛选筛选示意图示意图54 ( (二二) ) 限制性内切酶图谱鉴定限制性内切酶图谱鉴定55（三）（三） PCRPCR筛选重组体筛选重组体 抽提

37、少量重组抽提少量重组DNADNAPCRPCR扩增扩增电泳鉴定电泳鉴定序列分析。序列分析。（四）（四） 原位杂交技术原位杂交技术561 1、获取、获取TTTTAAAA质粒外源DNA分子TTAATTAAAATTEcoR IEcoR IAATT DNADNA重组基本过程重组基本过程( (小结小结) )572 2、重组、重组TTTTAAAAligaseTTAATTAAAATT“退火”AATT583 3、转化、转化转化到宿主细胞中(如E. coli)宿主细胞染色体DNA重组质粒重组质粒体体594 4、筛选、筛选筛选含有重组质粒的菌株宿主细胞染色体DNA重组质粒含有外源DNA的“工程菌”605 5、克隆、

38、克隆含有外源DNA的“工程菌”繁殖/扩增616 6、表达、表达表 达 产 物 分 离 纯 化表达产物分离纯化表达产物分离纯化62 五、重组体在宿主细胞中的表达和调控五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。质产品。 克隆基因表达有三个条件克隆基因表达有三个条件 基因的编码区不能被插入序列中断基因的编码区不能被插入序列中断; ; 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的细胞

39、的RNARNA聚合酶有效地识别聚合酶有效地识别; ; mRNA mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。63第四节第四节 重组技术在医学和制药工业中的应用重组技术在医学和制药工业中的应用 一、疾病基因的发现一、疾病基因的发现 19901990年年美国科学家率先启动美国科学家率先启动人类基因组计划人类基因组计划（HGPHGP），），计划历时计划历时1515年，至年，至20052005年完成；年完成； 20012001年年2 2月月1212日日由由SinceSince和和N

40、atureNature杂志同时向世界杂志同时向世界宣布，人类基因组宣布，人类基因组3X103X109 9bpbp的最新图谱，约含的最新图谱，约含3 3 4 4万个万个基因；基因； 整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类但要揭示人类4 4万个基因功能的任务将更为艰巨。万个基因功能的任务将更为艰巨。64 人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。类疾病相关基因提供了参照模板。 如已知

41、人类遗传性疾病约有如已知人类遗传性疾病约有30003000种，推测可能种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。推动作用。 65 产品名称产品名称 治疗功能与医药范围治疗功能与医药范围 1. 1. 人胰岛素人胰岛素 治疗糖尿病治疗糖尿病 2. 2. 人生长激素人生长激

42、素 治疗侏儒症，加速创口愈合治疗侏儒症，加速创口愈合 3. 3. 干扰素干扰素 治疗癌症、病毒感染治疗癌症、病毒感染 4. 4. 干扰素干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 5. 5. 干扰素干扰素 治疗癌症、病毒感染治疗癌症、病毒感染 6. 6. 人组织纤溶酶原激活因子人组织纤溶酶原激活因子( (tPAtPA) ) 溶解血栓，治疗急性心肌梗塞溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 7. 7. 红细胞生成素红细胞生成素 ( (EpoEpo) ) 治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 8. 8. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗

43、关节炎，缓解心肌坏死清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 9. 9. 凝血因子凝血因子 治疗治疗A A型血友病型血友病 10. 10. 乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗 防治肝炎防治肝炎 11. 11. 神经生长因子神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化维持神经元细胞存活、生长和分化 12. 12. 脑啡肤脑啡肤 镇痛镇痛 13. 13. 降钙素降钙素 治疗骨质疏松症治疗骨质疏松症二、二、 生产蛋白质和多肽类活性物质生产蛋白质和多肽类活性物质66 基因工程生产胰岛素的原理（示意图）基因工程生产胰岛素的原理（示意图） 67三、制备基因工程疫苗三、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术

44、难以解决的基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。一些特殊的病原体疫苗。如如，（1 1） 乙型肝炎病毒疫苗（乙型肝炎病毒疫苗（HBVHBV）、丙型肝炎病毒疫）、丙型肝炎病毒疫 苗（苗（HCVHCV）等；）等；（2 2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T T细胞免疫缺陷病毒（细胞免疫缺陷病毒（HITV-1HITV-1）等；）等；（3 3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4 4） 制备一些多价疫苗等。制备一些多价疫苗等。68四、改良物种特性四、改良物种特性69 动物药厂动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因通过转基因动物生产感兴趣的基因把把YFG放在放在乳球蛋白的启动子下乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊植入借腹怀孕的母羊体内体内YFG在乳腺中表达在乳腺中表达乳汁中提纯乳汁中提纯YFG蛋白。蛋白。 701. 1. 分离体细胞分离体细胞（先处于（先处于“饥饿饥饿”的的“静止状态静止状态”） 使使“关闭关闭”的的基 因 全 部基 因 全 部 “ 打打开开”。2. 2. 植入