药品微生物限度与无菌检查

1、Luzhou Institutes for Food and Drug Control药品微生物限度与无菌检查药品微生物限度与无菌检查风险管理风险管理 风险调查风险调查/ /评估评估微生物实验微生物实验室技术能力室技术能力药品微生物控制药品微生物控制风险管理、风险调查风险管理、风险调查/ /评估评估Luzhou Institutes for Food and Drug Control药品微生物检验的过程控制药品微生物检验的过程控制环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断过程控制Luzhou Institutes for Food and D

2、rug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug ControlUSP35USP35部分章节部分章节中国药典中国药典20152015年版年版Antimicrobial Effectiveness Testing抑菌效力检查法抑菌效力检查法Biological Indicators-Resistance Performance Tests生物指示剂抗性检查法生物指示剂抗性检查法Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests非无菌产品微生物检查

3、：微生物计数法非无菌产品微生物检查：微生物计数法Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms非无菌产品微生物检查：控制菌检查法非无菌产品微生物检查：控制菌检查法Microbiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Product非无菌药品微生物限度标准非无菌药品微生物限度标准Mycoplasma Tests支原体检查法支原体检查法Sterility Tests无菌检查法无菌检查法Biological Indic

4、ators for Sterilization灭菌用生物指示剂指导原则灭菌用生物指示剂指导原则Aplication of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Products水活度检查法用于非无菌药品微生物评价水活度检查法用于非无菌药品微生物评价Microbial Characterization, Identification, and Strain Typing微生物鉴定指导原则微生物鉴定指导原则Microbiological Evalution of Clean Rooms and Other Control

5、led Environments药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则Microbiological Best Laboratory Practices药品微生物实验室质量管理指导原则药品微生物实验室质量管理指导原则Sterility Testing-Validation of Isolator Systems无菌检查用隔离器系统验证指导原则无菌检查用隔离器系统验证指导原则Sterilization and Sterility Assurance of Compendial Articles灭菌法灭菌法Validation of Alternative M

6、icrobiological Methods药品微生物检验替代方法验证指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则/非无菌药品微生物限度检测指导原则非无菌药品微生物限度检测指导原则/（日本药典收载）（日本药典收载）中药饮片微生物限度检查法？中药饮片微生物限度检查法？药品微生物检验的过程控制药品微生物检验的过程控制环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断无菌检查用隔离系无菌检查用隔离系 统验证指导原则统验证指导原则药品微生物实验室药品微生物实验室 质量管理指导原则质量管理指导原则药品洁净实验室微生物药品洁净实验室微生物 检测和控制指导原则检测和

7、控制指导原则微生物鉴定微生物鉴定 指导原则指导原则药品微生物检验替代药品微生物检验替代 方法验证指导原则方法验证指导原则对照培养基al Institutes for Food and Drug Control案例案例阳性结果与玻璃安瓿表面采样菌高度相阳性结果与玻璃安瓿表面采样菌高度相似似NationLuzhou Institutes for Food and Dr无菌检查过程微生物控制无菌检查过程微生物控制 空气微生空气微生物物 浮游菌 沉降菌 表面微生物表面微生物 样品包装表面 操作人员手部易折方式影响折断力易折方式影响折断力 色环：通过在瓶颈喷涂与玻 璃膨胀系数不同的色釉产生 应力，从而使

8、断面平整灌装工艺落后造成折断灌装工艺落后造成折断 力差力差为防止灌装中安瓿断头安瓿折断后，断安瓿折断后，断面应平整。面应平整。Luzhou Institutes for Food and Drug Control国家药用包装容器国家药用包装容器（材料）标准（材料）标准YBB00332002YBB00332002点刻痕易折玻璃安瓿点刻痕易折玻璃安瓿点刻痕易折安瓿的色点应标记在刻痕的上方中心点刻痕易折安瓿的色点应标记在刻痕的上方中心 与中心线的偏差不得过与中心线的偏差不得过1.0mm1.0mm刻痕工艺控制不好刻痕工艺控制不好 深浅、长短、高低位置不一 色点和刻痕位置偏离规格尺寸不规范规格尺寸不规范

9、 瓶身外径精度不够 刻痕不易控制 瓶颈壁厚不均匀 折断后断面不平整玻璃材质不佳玻璃材质不佳 低硼硅玻璃：48.6% 中性硼硅玻璃：7.7% 我国90%以上低硼硅玻璃玻璃安瓿表面消毒方案比较玻璃安瓿表面消毒方案比较Luzhou Institutes for Food and Drug Control 杀孢子剂（过氧乙酸）喷洒后立即（3min、5min、10min）用 75%乙醇钝化，再用湿棉签擦拭取样 酒精灯过火1秒钟（3秒钟、5秒钟、10秒钟）后直接用湿棉签 擦拭取样表面消毒方案表面消毒方案作用时间作用时间残留菌落数残留菌落数菌属类型菌属类型杀孢子剂立即2cfuBacillus3min0cfu

10、/5min0cfu/10min0cfu/棉签擦拭&过火1秒钟4cfuBacillus、Brevibacillus3秒钟10cfuBacillus、Paenibacillus、Brevibacillus5秒钟0cfu/10秒钟0cfu/微生物检验的过程控制微生物检验的过程控制环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断过程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Control微生物实验室工作流程微生物实验室工作流程Luzhou Institutes for Food and Drug Control环境

11、保障环境保障WHO GPML 各区域等级Luzhou Institutes for Food and Drug Control微生物限度微生物限度 & & 无菌检查环境要无菌检查环境要求求无菌检查：无菌检查：环境洁净度环境洁净度B B级背景下的局部级背景下的局部A A级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中B+AB+Aoror隔离系统隔离系统中国药典中国药典20102010版版 万级下的百级万级下的百级中国药典中国药典20152015版版 药品洁净药品洁净实验室微生物监测和控制实验室微生物监测和控制指导原则指导原则无菌检查用隔离系统验证指导原

12、无菌检查用隔离系统验证指导原则则Luzhou Institutes for Food and Drug Control9205920592069206微生物限度检查：微生物限度检查：受控洁净环境下的局部洁净度不低于受控洁净环境下的局部洁净度不低于B B级的单向流空气区域内级的单向流空气区域内D+BSCD+BSC生物安全柜生物安全柜洁净室洁净室/ /台工作原理台工作原理层流层流 Laminar flowLaminar flow混流Conventional (mixed flow) cleanroomConventional (mixed flow) cleanroomLuzhou Institu

13、tes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control相关洁净标准比较相关洁净标准比较ISO 14644讨论了洁净室和受控环境的设计与建设按ISO 14644的分类分类是建立在环境中每单位体积的总体粒子数粒子数的基础上分类不区分非生物粒子或生物粒子相关洁净标准比较相关洁净标准比较2010版GMP洁净度级别标准“静态静态”百级，百级，“动态动态”万级万级Luzhou Institutes for Food and Drug Control相关洁净标准比较相关洁净标准比较20152015版版 建议的洁净实验室

14、环境监测频次及项建议的洁净实验室环境监测频次及项目目按ISO 14644的定级定级是建立在环境中每单位体积的总体粒子数粒子数的基础上Luzhou Institutes for Food and Drug Control定级定级不区分非生物粒子或生物粒子受控区域受控区域洁净级别洁净级别采样频次采样频次检测项目检测项目粒子粒子相邻外部每半年粒子粒子、浮游菌、沉降菌、表面菌粒子粒子B级每周粒子粒子、浮游菌、 沉降菌、表面菌粒子粒子D级每半年粒子粒子、浮游菌、 沉降菌、表面菌Luzhou Institutes for Food and Drug C“B级级”与与“C级级”的异同的异同ontrol悬浮粒

15、子与环境微生物悬浮粒子与环境微生物Luzhou Institutes for Food and Drug Control非生物粒子数量和活的微生物浓度之间的关系在科学 上未达成绝对的一致当操作人员是粒子的来源时，以下的结论是成立的， 即洁净室中的粒子越少，空气中微生物存在的可能性就洁净室中的粒子越少，空气中微生物存在的可能性就 越小越小。实验设备运行时大量产生的粒子污染和人员产生的粒子污染之间是无法明确区分的大量的药物除了微生物以外还有粒子限度的要求几乎肯定的是，部分悬浮粒子与微生物有关因此，洁净室监测应包括微生物微生物与粒子粒子数两方面洁净室使用次数与浮游菌数关系洁净室使用次数与浮游菌数关系

16、416#浮游菌数201月2月3月4月5月6月7月8月9月10月 11月 12月681016141213#使用次数13#浮游菌数16#使用次数Luzhou Institutes for Food and Drug Control近近8 8年无菌室年无菌室C C级浮游菌高限图级浮游菌高限图9090808070706060505040403030202010100 020072007200820082009200920102010201120112012201220132013201420147 7月月8 8月月9 9月月硬件差异软件差异Luzhou Institutes for Food and

17、Drug Control洁净区微生物监测水平USP35USP3515 cfu 15 cfu 信息性，信息性， 非标准性非标准性Luzhou Institutes for Food and Drug Control监控基于风险评估监控基于风险评估120100806040200法规标准 OOT行动限 OOE警戒限 常规波动WHO good practices for pharmaceutical microbiology laboratoriesAppendix 4Examples of equipment qualification and monitoringLuzhou Institutes

18、 for Food and Drug Control环境微生物归属环境微生物归属Luzhou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control欣弗事件欣弗事件欣弗培养物洁净环境常见菌： 头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） 山羊

19、葡萄球菌（Staphylococcus caprae）肺炎克雷伯巨大芽孢杆菌粘质沙雷菌夺命的欣弗编号鉴定结果0206L1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、粘质沙雷菌（S.marcescens）0206G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、粘质沙雷菌（S.marcescens）298L；298G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘质沙雷菌（S.marcescens）303L；303G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、阴沟肠杆菌（Enter. cloacae）305L；305G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘质沙雷

20、菌（S.marcescens）306L/6G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）307G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）308L粪产碱杆菌（Al.faecalis）309L粪产碱杆菌（Al.faecalis）304G嗜麦芽寡养单胞菌（S.maltophilia）不同生物安全水平对设施的要求不同生物安全水平对设施的要求Luzhou Institutes for Food and Drug Control不同保护类型及生物安全柜的选择不同保护类型及生物安全柜的选择Luzhou Institutes for Food and Drug ControlI级安全柜适用于一级，二级和三级安全实

21、验室， II级和III级安全柜则适用于所有级别安全实验室。保护类型生物安全柜的选择个体防护，针对生物危险等级13级微生物级、级生物安全柜个体防护，针对生物危险等级4级微生物， 手套箱型实验室级生物安全柜个体防护，针对生物危险等级4级微生物， 防护服型实验室级、级生物安全柜实验对象保护级生物安全柜，柜内气流是层流的级生物安全柜少量挥发性放射性核素化学品的防护级B1型生物安全柜，外排风式 级A2型生物安全柜挥发性放射性核素化学品的防护级、级B2型、级生物安全柜Luzhou Institutes for Food and Drug ControlClass I 生物安全柜生物安全柜适用于样品不需保护

22、的工作适用于样品不需保护的工作1、从前窗口吸入的负压气流，用以保护人员的安全； 2、排出的气流经HEPA过滤器过 滤，用以保护环境，不受污染； 3、对受试样本，不能提供切实 可靠的保护。无外接风道有外接风道Contaminated air under negative pressure Contaminated air under positive pressureHEPA-filtered airRoom airLuzhou Institutes for Food and Drug ControlII级级A2型生物安全柜型生物安全柜前窗进风气流平均流速0.50m/s 生物安全柜排风管道接口

23、与建筑物排风系统相连接 可以从事少量的的挥发性 有毒化学物质或放射性的 工作。Luzhou Institutes for Food and Drug Control在生物安全柜上工作在生物安全柜上工作干净的物品工作台摆放被污染的区域废弃物托盘垃圾袋Luzhou Institutes for Food and Drug Control无菌隔离系统与传统洁净技术的对比无菌隔离系统与传统洁净技术的对比Luzhou Institutes for Food and Drug Control项目项目消毒消毒/ /灭菌方灭菌方 法法洁净环境的洁净环境的 控制控制对操作人员对操作人员 的防护的防护物料传送方物

24、料传送方 式式人员进出人员进出运行所需能运行所需能 耗耗误操作导致误操作导致 的无菌环境的无菌环境 污染的风险污染的风险传统 洁净 技术消毒剂擦拭/ 熏蒸/紫外线 照射等方法受 空间等诸多因 素影响效果难 以验证易受人员、 物料等诸多 因素影响， 易受污染， 难以控制；取决于操作 人员自身技 术和熟练程 度；传统的传递 窗，易导致 无菌室环境 破坏和物料 的污染；需复杂的换 鞋/工作服 更换等步骤 带来额外工 作量；高，误操作可能 性大，与操 作人员有较 大相关性无菌 隔离 器技 术自动气体灭菌 省时省力， 气体分布均匀 效果较好，容 易验证；， 与外界完全 隔离，仅通， 过HEPA进行 空气

25、交换并 可恒定舱内 压力以阻绝 外界污染；安全系数高双门快速传 递系统保证 在无菌环境 中传递，无 菌保证程度 高；仅通穿戴手 套/半身工 作服即可；低可能性极小Na隔离器隔离器2x3-glove IsotestH2O2溶液被泵入蒸发器 液态H2O2 气态H2O210 SAL表面杀灭效率-6tional Institutes for Food and Drug Control隔离器隔离器9209206 6 无菌检查用隔离系统验证指导原则无菌检查用隔离系统验证指导原则1.操作验证3.灭菌验证4.灭菌循环验证2.完整性验证5.内部洁净度验证6.仪器仪表验证Luzhou Institutes for

26、 Food and Drug ControlLuzhou Institutes forFood and Drug Control三种主要设备比较三种主要设备比较生物安全柜生物安全柜层流柜层流柜无菌隔离器无菌隔离器人员保护环境要求样品保护处理样品灵活性操作难度运行维护难度微生物检验的过程控制微生物检验的过程控制环境保证培养基保证培养基保证无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断过程控制Luzhou Institutes for Food and Drug ControlChPChP无菌检查培养基与无菌检查培养基与USPUSP、BPBP的比较

27、的比较Luzhou Institutes for Food and Drug Control硫乙醇酸盐流体培养基（Fluid Thioglycollate Medium）药典药典USPUSPBPBP中国药典中国药典-2015-2015名称名称Fluid Thioglycollate Fluid Thioglycollate Medium Medium 硫乙醇酸盐流体培养硫乙醇酸盐流体培养基基Fluid Thioglycollate Fluid Thioglycollate Medium Medium 硫乙醇酸盐流体培养硫乙醇酸盐流体培养基基Fluid Thioglycollate Fluid

28、Thioglycollate Medium Medium 硫乙醇酸盐流体培硫乙醇酸盐流体培养基养基目的目的培养需氧、厌氧和微需氧微培养需氧、厌氧和微需氧微 生物生物（主要是厌氧菌）（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧和微需氧微培养需氧、厌氧和微需氧微 生物生物（主要是厌氧菌）（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧微生物培养需氧、厌氧微生物培养条件培养条件1414天于天于30-35 30-35 C C及及20-25 20-25 C C配方配方Pancreatic Digest of Casein(Pancreatic Digest of Casein(胰酪蛋白胨胰酪蛋白胨).15.0 g Yeast ).15

29、.0 g Yeast Extract(Extract(酵母浸出粉酵母浸出粉) .5.0 g) .5.0 gDextrose(Dextrose(葡萄糖葡萄糖).5.5 g).5.5 gSodium Chloride(Sodium Chloride(氯化钠氯化钠).2.5 g).2.5 gL-Cystine( L-L-Cystine( L-胱氨酸胱氨酸) .0.5 g) .0.5 gSodium Thioglycollate (Sodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠硫乙醇酸钠).0.5 g Agar( ).0.5 g Agar( 琼琼脂脂).0.75 g).0.75 gResaz

30、urin( Resazurin( 刃天青刃天青) .1.0 mg) .1.0 mgChPChP无菌检查培养基与无菌检查培养基与USPUSP、BPBP的比较的比较Luzhou Institutes for Food and Drug Control大豆胰酪胨培养基(TSB) & 改良马丁培养基药典药典USP36BP-2013中国药典中国药典2010版版中国药典中国药典2015版版名称名称Tryptic Soy Broth (Soybean casein Soybean casein digest medium)digest medium)大豆胰酪大豆胰酪 胨培养胨培养基基改良马丁培养基改

31、良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基配方配方胰酪蛋白胨胰酪蛋白胨.7.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物大豆木瓜蛋白酶消化物.3.0g氯化钠氯化钠.5.0g 磷酸氢二钾磷酸氢二钾.2.5g 一水葡萄糖一水葡萄糖.2.5g蛋白胨蛋白胨.5.0g 酵酵母浸出粉母浸出粉.2.0g葡萄糖葡萄糖.20.0g 磷磷酸氢二钾酸氢二钾.1.0g硫酸镁硫酸镁(MgSO4.7H2O).0.5g胰酪胨胰酪胨 17.0g 17.0g 大豆木大豆木瓜蛋白酶水解物瓜蛋白酶水解物3.0g3.0g氯化钠氯化钠 5.0g5.0g磷酸氢二钾磷酸氢二钾2.5g2.5g葡萄糖葡萄糖/ /无水葡萄糖无水葡萄糖2.5g /2.3

32、g2.5g /2.3g目的目的支持广泛微生物的生长支持广泛微生物的生长, ,包括需氧菌包括需氧菌 专性和兼性厌氧菌、专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是真菌（主要是 需氧菌）需氧菌）、用于培养、用于培养真菌真菌支持广泛微生物的生长支持广泛微生物的生长, ,包包 括需氧菌、专性和兼性厌氧括需氧菌、专性和兼性厌氧 菌、菌、真菌（主要是需氧菌）真菌（主要是需氧菌）培养培养 条件条件14天于天于30-35 C及及20-25 C14天于天于20-25 C14天于天于30-35 C及及20-25C微生物实验室常用菌株微生物实验室常用菌株 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B

33、B) 10104 大肠埃希菌（Escherichia coli） CMCC(B B) 44102 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMCC(B B) 26003 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B B) 64941 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)G+芽孢杆菌 CMCC(B B) 63501G-杆菌G+球菌酵母菌霉菌兼性需氧菌专性厌氧菌专性需氧菌 白色念珠菌 (Candida albicans)CMCC(F F) 98001 黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC(F F) 98003Luz

34、hou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control在硫乙中生长差异在硫乙中生长差异仅仅 在在 厌厌 氧氧 层层 生生 长长需需 氧氧 层层 厌厌 氧氧 层层 均均 生生 长长铜绿假铜绿假单胞菌单胞菌( (PseudomPseudomonas onas aeruginoaeruginosasa) )仅仅 在在 需需 氧氧 层层 生生 长长CMCC(B) 10104CMCC(B) 10104大肠埃希菌（大肠埃希菌（Escherichia coliEscherichia coli） C

35、MCC(B) 44102CMCC(B) 44102金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 ( (Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus) ) CMCC(B) 26003CMCC(B) 26003生孢梭菌生孢梭菌( (Clostridium sporogenesClostridium sporogenes) ) CMCC(B) 64941CMCC(B) 64941枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 ( (Bacillus subtilisBacillus subtilis) ) CMCC(B) 63501CMCC(B) 63501方法适用性内容修订方法适用性内容修订Lu

36、zhou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control微生物计数定义变化修订前修订后内容细菌数营养琼脂霉菌和酵母菌数玫瑰红钠琼脂（1）需氧菌总数（TAMC）。（2）霉菌和酵母菌总数（TYMC）。（3）需氧菌总数：生长在胰酪大豆胨琼脂（TSA）上所 有菌落(包括霉菌和酵母菌)。（4）霉菌和酵母菌总数：一般指生长在沙氏葡萄糖琼 脂（SDA）上的所有菌落(包括细菌)。如果由于细菌 的生长而使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物 限度要求，可使用含有抗生素的SDA重新计数。对照培养基培养基质

37、量控制：培养基质量控制： USP之前验证过的 中国药典对照培养基对照培养基单剂量免称量独立包装 专利号： ZL200920108836.8回收率 待测培养基平均菌落数（cfu ）*100%对照培养基平均菌落数（cfu）Luzhou Institutes for Food and Drug Control50%200%Luzhou Institutes for Food and Drug Control培养基适用性检查范围液体、固体培养基加菌量不大于100cfu培养温度胰酪大豆胨琼脂：3035 培养； 胰酪大豆胨肉汤：3035 培养； 沙氏葡萄糖琼脂：2025 培养。培养时间细菌不大于72h，真

38、菌不大于5天。可接受标准固体培养基：50200（0.52）液体培养基：生长良好。Luzhou Institutes for Food and Drug Control培养基适用性检查培养基名称胰酪大豆胨肉汤（TSB）无菌性检查取已灭菌的TSB，于30-35培养不少于3天，培养基应澄清。试验用菌株枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌接种方法分别接种各试验用菌悬液于该培养基中，接种量不大于100cfu， 摇匀，培养。适用性检查接种试验用菌株后，30-35培养不超过72小时，与对照培养基比 较，试验菌应生长良好。（建议：培养基呈混浊的液体，或划线 于相应的分离平板上，培养后呈现典型菌落）备注：

39、该培养基同时用于稀释液的制备和控制菌检查时，需要考虑同时满足计数和 控制菌检查培养基适用性检查控制要求。Luzhou Institutes for Food and Drug Control培养基适用性检查培养基名称胰酪大豆胨琼脂（TSA）无菌性检查取已灭菌TSA注皿，于30-35培养35天，应无菌落生长。试验用菌种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉接种方法涂布法：表面接种不大于100cfu试验用菌悬液于TSA平板表面； 倾注法：接种不大于100cfu试验用菌悬液于无菌平皿，倾注该培 养基，轻轻摇匀。适用性检查枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌于30-35培

40、养不 超过3天；白色念珠菌、黑曲霉于30-35培养不超过5天。与对照培养基比较，恢复率在50200之间。Luzhou Institutes for Food and Drug Control培养基适用性检查培养基名称沙氏葡萄糖琼脂（SDA）无菌性检查取已灭菌的SDA注皿，于20-25培养57天，应无菌落生长。试验用菌种白色念珠菌、黑曲霉接种方法涂布法：表面接种不大于100cfu试验用菌悬液于SDA平板表面。 倾注法：接种不大于100cfu试验用菌悬液于无菌平皿中,倾注该培 养基，轻轻摇匀。适用性检查 白色念珠菌、黑曲霉于20-25培养不大于5天。与对照培养基比较，恢复率在50200之间。备注：

41、如该培养基用于控制菌白色念珠菌的检查时，同时需要满足控制菌项下培养基适用性检查要求。Luzhou Institutes for Food and Drug Control培养基适用性检查培养基名称沙氏葡萄糖琼脂+抗生素（当细菌超标引起霉菌和酵母菌总数超标用）无菌性检查取已灭菌的SDA注皿，于20-25培养57天，应无菌落生长。试验用菌种抑菌性检查：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌促生长能力：白色念珠菌、黑曲霉常用抗生素1、庆大霉素：广谱。对G-，G+菌有较好的抗菌作用。2、氯霉素：广谱。对G-菌作用强；对G+菌作用不及青霉素与四环素。接种方法抑菌性：接种不少于100cfu试验用菌。

42、促生长能力：接种不大于100cfu试验用菌。适用性检查白色念珠菌、黑曲霉于20-25培养不大于5天。与对照培养基比 较，恢复率在50200之间。枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌应不得生长。Luzhou Institutes for Food and Drug Control样品：乌鸡白凤丸乌鸡白凤丸乌鸡白凤丸胰酪大豆胨琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基疑似菌落做革兰染色 革兰阳性杆菌 不属于霉菌或酵母菌。将无菌硫酸庆大霉素将无菌硫酸庆大霉素（相当于相当于20mg20mg庆大霉素庆大霉素）胰酪胨大豆琼脂培养基胰酪胨大豆琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基。玫瑰红钠琼脂培养基。Luzhou Inst

43、itutes for Food and Drug Control选择性培养基适用性选择性培养基适用性控制菌检查控制菌检查培养基培养基特性特性试验菌株试验菌株大肠菌大肠菌群群乳糖胆盐发酵培养基乳糖胆盐发酵培养基促生长能力促生长能力E.coliE.coli乳糖发酵培养基乳糖发酵培养基抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus促生长能促生长能力力+指示能力指示能力E.coliE.coliEMB或麦康凯琼脂或麦康凯琼脂促生长能力促生长能力+指示能力指示能力E.coliE.coli大肠埃希菌大肠埃希菌胆盐乳糖培养基胆盐乳糖培养基促生长能力促生长能力E.coliE.coliMUG、EMB或麦康凯琼脂

44、或麦康凯琼脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus促生长能力促生长能力+指示能力指示能力E.coliE.coli沙门菌沙门菌营养肉汤培养基营养肉汤培养基促生长能力促生长能力S S paratyphparatyphi i B B四硫磺酸盐亮绿培养基四硫磺酸盐亮绿培养基促生长能力促生长能力S S paratyphparatyphi i B BDHL或或SS琼脂、琼脂、EMB或麦康凯琼脂或麦康凯琼脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus促生长能力促生长能力+指示能力指示能力S S paratyphparatyphi i B B三糖铁琼脂三糖铁琼脂指示能力指示能力S S parat

45、yphparatyphi i B BLuzhou Institutes for Food and Drug Control选择性培养基适用性选择性培养基适用性控制菌检查控制菌检查培养基培养基特性特性试验菌株试验菌株铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基胆盐乳糖培养基促生长能力促生长能力P.aeruginosaP.aeruginosa溴化十六烷基三甲铵琼脂溴化十六烷基三甲铵琼脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus促生长能力促生长能力P.aeruginosaP.aeruginosa绿脓菌素测定用培养基绿脓菌素测定用培养基抑制能力抑制能力E.coliE.coli促生长能力促生长能力+指示

46、能力指示能力P.aeruginosaP.aeruginosa金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基亚碲酸盐肉汤培养基促生长能力促生长能力S.aureusS.aureus甘露醇高盐琼脂或卵黄氯化甘露醇高盐琼脂或卵黄氯化钠钠琼脂琼脂抑制能力抑制能力E.coliE.coli促生长能力促生长能力+指示能力指示能力S.aureusS.aureus抑制能力抑制能力E.coliE.coli梭菌梭菌梭菌增菌培养基梭菌增菌培养基促生长能力促生长能力ClCl. . sporogenessporogenes哥伦比亚琼脂哥伦比亚琼脂促生长能力促生长能力ClCl. . sporogenessporogenes白

47、色念珠菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤沙氏葡萄糖肉汤促生长能力促生长能力C.albicansC.albicans沙氏葡萄糖琼脂沙氏葡萄糖琼脂促生长能力促生长能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans念珠菌显色培养基念珠菌显色培养基促生长能力促生长能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans1%聚山梨酯聚山梨酯80-玉米琼脂培养基玉米琼脂培养基抑制能力抑制能力E.coliE.coli促生长能力促生长能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans微生物检验的过程控制微生物检验的过程控制环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证方法验证S

48、OP操作有效的结果可靠的结论结果判断过程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Control检测方法验证标准（药典）检测方法标准（药典）检测方法实验室在进行常规检测前应证明该实验室可以满足标准检测方法 中的某些性能指标（即方法确认），并证明某一方法适用于某产 品的检测（方法适用性包括阳性对照和阴性对照）。新建方法方法验证与方法适用性药典方法（其他成熟方法）方法转移与方法确认（部分菌株的验证）有案可查、溯源性 ； 建立实验室自身的方法依据体系其他其他准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、粗放性Luzhou Institutes for Food an

49、d Drug Control验证的一般程序与环节验证的一般程序与环节需前处理需前处理不需前处理不需前处理无抑菌作用无抑菌作用样品样品检查检查验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。验证抑菌活性去除的有验证抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法对污效性，以及去除方法对污 染菌生长、检出的影响。染菌生长、检出的影响。可以通过验可以通过验 证实验判断证实验判断药品微生物检查方法验证的一般程序与环节药品微生物检查方法验证的一般程序与环节利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响 通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。Luzhou Institutes for

50、 Food and Drug Control有抑菌作用有抑菌作用去除抑菌作用去除抑菌作用吐温吐温8080结构结构乳化剂降低了混合体系中各组分的界乳化剂降低了混合体系中各组分的界 面张力，并在微滴表面形成较坚固的面张力，并在微滴表面形成较坚固的 薄膜薄膜由于乳化剂给出的电荷而在微滴表面由于乳化剂给出的电荷而在微滴表面 形成双电层，阻止微滴彼此聚集，而形成双电层，阻止微滴彼此聚集，而 保持均匀的乳状液。保持均匀的乳状液。Luzhou Institutes for Food and Drug Control分装5份 9.9ml供试液+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液+ 0.

51、1ml金黄色葡萄球菌液+ 0.1ml铜绿假单胞菌液+ 0.1ml枯草芽孢杆菌液+ 0.1ml白色念珠菌液+ 0+.01m.1lm黑l黑曲曲霉霉菌菌液液+ 0.1ml铜绿假单胞菌液+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液+ 0.1ml铜绿假单胞菌液+ 0.1ml枯草芽孢杆菌液+ 0.1ml金黄色葡萄球菌液+ 0.1ml铜绿假单胞菌液+ +00.1.1mml白l白色色念念珠珠菌菌液液+ 00.11mmll枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌液液+00.1.m1mll金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌液液+ 00.11mmll铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌液液根据供试品的理化 特性与生物学特性，采取适宜的方法制备合适的供试液。稀释度

52、依据样品特稀释度依据样品特 性，质量标准制定性，质量标准制定计数方法适用性试验保证平皿中的菌数不大于100cfuLuzhou Institutes for Food and Drug Control微生物检验的过程控制微生物检验的过程控制环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断过程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Control微生物限度案例某板蓝根冲剂，标准为细菌数不得过1000cfu/g，某药检所细菌数 结论1200cfu/g，送中检院仲裁。(1)方法适用性合格合格Luzhou Ins

53、titutes for Food and Drug Control不合格不合格Luzhou InstituteDrug Control菌种传代保藏流程菌种传代保藏流程1 BioBall3 推荐方式2 自动稀释s for Food andLuzhou Institutes for Food and Drug Control试验用菌株的传代次数不得超 过5代（从菌种保存中心获得的冷 冻干燥菌种为第0 代）。代的定义：每接种一次即为一 代（有在新鲜的培养基上生长过程) 传代示意图：干燥菌种（0代）QCCV1CV2CV3液体培养基复苏（1代）工作菌株传代保藏规程菌种传代流程S1S2 S3QCS1S2S

54、3 第二代工作菌悬液冷藏（零下20）cv1 CVcv2 cv3cv4QCCycle 1第一代储备管 冻存（零下30或70 ）冻干菌种第二代工作菌斜面冷藏（28） 鉴别cv11cv2cv3cv36Cycle 2第二代储备管冻存（零下30或70 ）QCTSBQC工作菌株传代保藏流程示意图Luzhou Institutes for Food and Drug Control。微生物检验的过程控制微生物检验的过程控制环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作操作有效的结果可靠的结论结果判断过程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Contr

55、ol实验操作实验操作 物料进场物料进场消毒液搽拭消毒液搽拭 物品外表面物品外表面洁净传递洁净传递（风淋、紫外照射）（风淋、紫外照射）核心区外围消毒剂清洁外表面外围消毒剂清洁外表面Luzhou Institutes for Food and Drug Control双层无菌包装双层无菌包装外围实验操作实验操作 人员进场人员进场一更Luzhou Institutes for Food and Drug Control二更Luzhou Institutes forFood and Drug Control硫乙 阴性 090423马丁 阴性 090423马丁样品 090423硫乙样品 090423马丁

56、阳性 090423硫乙阳性 090423监控平板样品沉降菌 手指无菌检验框架示意图无菌检验框架示意图Luzhou Institutes for无菌三针单联管无菌三针单联管Food and Drug Control实验过程监控实验过程监控表面监控手部监控环境菌监控Luzhou Institutes for Food and Drug Control无菌程序保障无菌程序保障无菌检查样品前处理无菌检查样品前处理分批消毒、实验（混合） 统一消毒，统一实验严格遵守外表面消毒程序严格遵守外表面消毒程序一般环境酚类 （phenylphenol/ tertiary amylphenol ） 洁净环境过氧乙酸+

57、75%乙醇（无菌级）（苯式苯酚/三级戊基苯酚）增加过程监控力度增加过程监控力度 表面菌采样、手部采样（每批）、动态浮游菌采样（下风口）Luzhou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes forFood and Drug Control明确标识Paper labels are preferredover marker pens.原始记录原始记录样品信息&方法信息仪器信息&状态检验结论前置 方便核验校对&复核信息前置Luzhou Institutes for Food and Drug Control原始

58、记录原始记录样品信息一致材料信息&试剂信息Luzhou Institutes for Food and Drug Control检验方法描述检验结果记录原始记录原始记录样品信息一致过程监控信息包括监控方案培养条件 培养结果 及培养基信息是否启动偏差调查记录Luzhou Institutes for Food and Drug Control原始记录原始记录样品信息 环境保障调查仪器运转 环境监控检验操作调查 培养基、检验用具 阴性、阳性对照 操作细节结果判断调查Luzhou Institutes for Food and Drug Control微生物检验的过程控制微生物检验的过程控制

59、环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断结果判断过程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Control结果判断结果判断Luzhou Institutes for Food and Drug Control阳性（+）阴性（-） 供试品管浑浊，即判不合格 除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非 供试品所含 设备，环境的微生物监控结果超标 回顾实验过程，发现污染因素 鉴定微生物，确认是操作引入的无菌试验经确认无效，可重试药品无菌检验的溯源性分析药品无菌检验的溯源性分析药品微生物实验室环境/过程微生物的

60、监测药品的微生物检测环境/过程细菌与药品 细菌的比较结论产品污染实验污染污染源排除重试溯源分析整改Luzhou Institutes for Food and Drug Control药品微生物实验环境微生物 的监测药品的微生 物检测环境微生物与阳性结果的比较结论保证药品微生物检验结果可靠的有效途径过程微生物信息的全面性微生物鉴定结果的准确性Luzhou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control各类常见微生物的菌落特征各类常见微生物的菌落特征微生物类别菌落特征单细胞微生物菌丝状微生物细菌酵母菌放线菌霉菌主 要